Способ выделения ферментных препаратов

Способ выделения ферментных препаратов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(11) 543670

Союз Советских

Социалистимеских

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 03,07.74 (21) 2040849/13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет (43) Опубликовано 25.01.77. Бюллетень № 3 (45) Дата опубликования описаиия18.05,77 (51) М. Кл. C12D13(10

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР ао делам изобретений и открытий (53) УДК 576.8.093.1 (088.8) (72) Авторы изобретения

Латвийский филиал Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института химических реактивов и особо чистых химических веществ "ИРЕА" и Олайнский завод химических активов (71) Заявители (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов, например каталазы, широко применяемых в медицине, биохимии, пищевой промышленности.

Известны способы выделения ферментных.препаратов, например каталазы, из микробиологического сырья методом ультрафильтрации путем концентрирования растворов ферментов, например каталазы. Однако для известных методов характерны потери активности фермента вследствие его инактивации.,Пля каталазы эти потери составляют 7-46% (1) .

Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения ферментных препаратов, предусматривающий концентрирование культуральной жидкости ультрафильтрацией и последующе извлечение фермента на распылительных или лиофильных сушилках.

Процесс ультрафильтрации по известному способу проводят при температуре окружающей среды и использованием мембраны для удаления низкомолекулярных примесей (21.

В предлагаемом способе выход ферментного препарата низок из-за нестабильности ферментного раствора.

Целью изобретения является увеличение выхода готового продукта и стабилизация фермента.

Предлагаемый способ выделения ферментных препаратов, например каталазы, из культуральной жидкости, предусматривающий концентрировакле последней ультрафильтрацией и последующее извлечение фермента, отличается тем, что к культуральной жидкости перед ультрафильтрацией добавляют водорастворимый полиэлектро10 лит класса ионитов,например вещество формулы

C(, l — Â1 — Ì(.EHg)g Cl j где R> — радикал стирала, или вещество формулы „, . йнд) с> с,н

20 где Вз — радикал изопропилметакрилата.

Водорастворимый полизлектролит добавляют в количестве 0,1 — 0,15 мг на 1000 ед. активности фермента.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение активности фермента. вследствие его стабилизации, А. М. Ирген, E. Д. Ермолаев, Л. Л. Яворковская, И. И. Брод, О. А. Стенгревиц, П вЂ”,Р. А. Станкевич, И. Ю. Ниедра, И. К. Шнитко, Ю. И. Дытнерский, P. Ю, Аре и P. Я. Карклиньш

543670

15

30

Ш114ПП И Заказ б 125/53

Тираж Д 7 Я Подписное

Филиал ППП" Патент ". г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Стабилизация фермента в концентрируемом растворе при введении полиэлектролита типа ионита происходит в результате полного вхаимодействия противоположно заряженных молекул фермента и вводимого полиэлектролита, Указанное взаимодействие предотвращает денатурацию фермента при ультрафильтрации у поверхности мембраны, исключая 30%-ные потери активности фермента, что обеспечивает последующее выделение ферментного препарата с выходом до 95%.

Предлагаемый способ получения ферментных препаратов заключается в том, что к культуральному раствору фермента после удаления микробной биомассы добавляют стабилизирующий агент-водорастворимьй полиэлектролит класса ионитов — и затем проводят процесс ультрафильтрации с использованием сепарирующей мембраны, концентрируя ферментньй раствор с одновременным удалением низкомолекулярных примесей. При степени концентрирования почти в 40 раз активность стабилизированного ферментного раствора возрастает также в 40 раз. Последующее извлечение ферментного препарата вакуумной сушкой из концентрата обеспечивает выход готового продукта до 95%.

Пример 1, Культуральньй раствор каталазы объемом 38 л с начальной активностью 800 ед/мл центрифугируют и фильтруют для отделения биомассы. К фугату добавляют 80 мл 5%-ного водорастворимого полиэлектролита формулы

И151 1 Ю(С 5)ЗС1 l„ где R> — радикал стирола.

После этого фугат концентрируют ультрафильтрацией до 1 л. Сконцентрированный раствор промывают 5 л дистиллированной воды. Активность концентрата 32 ед/мл раствора, т.е. выход по активности в концентрате 107%.

Концентрат упаривают в вакууме при 30 С досуха. Выход сухого препарата каталазы 14 г,удельная 40 активность 3000 ед/мг белка или активность

?000 ед/мг препарата, т.е. выход готового продукта составляет 94%.

Пример 2. Культуральный раствор каталазы объемом 20 л с начальной активностью 2100 ед/мл 45 центрифугируют для отделения биомассы, а затем к фугату добавляют 40 мг 10%-ного раствора водорастворимого полиэлектролита формулы где В, — радикал изопропилметакрилата.

Помутневший фугат перемешивают,. отделяют

55 небольшой осадок декантацией и фильтрацией. К прозрачному раствору фермента добавляют еще

20 мл 10%-ного раствора того же полиэлектролита.

Раствор фермента с добавкой стабилизатора концентрируют до 0,7 л, а затем концентрат диафильтрацией промывают сначала 2л 0,1 м фосфатного буфера, имеющего рН 8,0, а затем 3 л дистиллированной воды. Активность концентрата 60000 ед/мл > выход по активности в концентрате 99%.

Концентрат упаривают досуха в вакууме при

30 С, Выход сухого препарата каталазы 10 г, удельная активность 5100 ед/мг белка или активность

4000 ед/мг препарата, т.е. выход готового продукта

95%.

Таким образом, предлагаемьй способ обеспечивает высокий выход (до 95%) готового ферментного препарата и стабилизацию фермента, позволяющую в свою очередь, предотвратить 30%-ные потери активности.

Формула изобретения

1. Способ выделения ферментных препаратов, например каталазы, из культуральной жидкости, предусматривающий концентрирование последней ультрафильтрацией и последующее извлечение фермента из концентрированной культуральной жидко сти, отличающийся тем,что,сцельюувеличения выхода готового продукта и стабилизации фермента, к культуральной жидкости перед ультрафильтрацией добавляют водо ра ство римый полиэлектролит класса ионитов.

2. Способно п. 1, отличающийсятем,что в качестве водорастворимого электролита используют вещество формулы ссе, j-к„- и (сн,), сГ), где R, — радикал стирола.

3. Способ по п. 1,î т л и ч а ю шийсятем, что в качестве водорастворимого полиэлектролита используют вещество формулы

Г + - (СИ ) С1 5 5 где Rz — радикал изопропилметакрилата.

4. Способ по пп.1, 2, 3, отличающийся тем, что водорастворимый полиэлектролит добавляют в количестве 0,1 — 0,15 мг на 1000 ед, активности фермента.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. "Biotechnology and Bioengineering", 1971,т. 13. стр. 185.

2. "Chemical and Process Engineering", 1970, т. 51, N 12, стр. 49 — 51, (прототип).