Способ выделения -аспарагиназы

Способ выделения -аспарагиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

О П И С А Н И Е (ii) 54з671

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 03.02.75 (21) 2105024/13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 25.01.77. Бюллетень № 3 (45) Дата опубликования описания18.05.77 (51) М, Кл. C 12 Э 13/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) Н. С. Бондарева, М. М. Левитов, А. Н, Мешков, P. Д. Сойфер, А. А. Минина и Л. А. Михайлова (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Всесоюзный научно — исследовательский институт антибиотиков (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ L — АСПАРАГИНАЗЫ

Изобретение относится к способам получения медицинских препаратов, а именно фермента L — аспарагиназы (1.— аспарагинамидогидролазы — 3, 5, 1, 1), обладающего противоопухолевой активностью.

Известен способ получения препарата L— - аспаоагиназы из биомассы микроорганизма Е.Со Рл, заключающийся в том, что биомассу, отделенную от культуральной жидкости, обрабатывают смесью воды и ацетона, после чего фермент экстрагируют из биомассы водой при рН 7,5-7,8 и для отделения бесклеточного экстракта в суспензию вводят раствор органического основания. Фермент осаждают из бесклеточного экстракта 4 объемами ацетона, полученный осадок отделяют, промывают ацетоном и высушивают, получая грубый препарат фермента с удельной активностью 3 МЕ/мг белка. Последующая очистка L — аспарагиназы состоит в нагревании раствора фермента до 60 С при рН 8,5 с целью удаления балластных белков, повторном фракционировании ацетоном, фракционированном разделении белков полиэтиленгликолем в щелочной области рН в присутствии амидов, отделении балластных белков путем пов торного прогревания раств ора фермента в присутствии глицина или подкисления его, фракпионированном осаждении фермента при рН, соответствующем его изоэлектрической точке, Выход L — аспарагиназы седельной активностью 190-203 МЕ/мг белка составляет 24-34% (1) .

5 Цель изобретения состоит в упрощении процесса и увеличении выхода целевого продукта.

Для этого в предлагаемом способе фермент осаждают из бесклеточного экстракта при рН

6,8-7,2 ацетоном в соотношении ацетон: бесклеточ1р ный экстракт 0,8-1,0:1,0, полученный осадок растворяют и после его осветления фракционно осаждают балластные белки и 1 — аспарагиназу полиэтиленгликолем при рН 5,0-5,5. Далее фермент очищают двукратной перекристаллизацией из раствора снача1а ла в присутствии этанола при рН 5,0-6,0, а затем полиэтиленгликолем при рН 5,0-5,5.

Способ вьщеления L — аспарагиназы заключается в следующем. Биомассу, полученную в результате культивирования микроорганизма Е, Co i i, обрабатывают ацетоном, затем фермент из биомассы извлекают водной экстракцией при рН 6,8-7,2 и бесклеточный экстракт отделяют после добавления к суспензии водорастворимого анионита. фермент осаждают 0,8-1,0 объемом ацетона, осадок растворяют и полученный прозрачный раствор, содержа543671

Тираж 578 цНИИПИ Заказ 6125/53

Подписное

Филиал ППП " Патент ", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 щий L — аспарагиназу, обрабатывают при рН 5,0-5,2 полиэтиленгликолем для последовательного осаждения балластных белков и фермента. Последующая очистка L — аспарагиназы состоит в перекристаллизации фермента из буферного раствора при рН

5,0-6,0 в присутствии этанола, и затем при рН

5,0- 5,5 в присутствии полиэтиленгликоля.

Предлагаемый способ позволяет получить препарат L — аспарагиназы с удельной активностью

180-220 МЕ/мг белка при выходе 45-50%.

Пример 1. Клеточную биомассу с общим содержанием фермента7,0 млн. МЕ, полученную в результате культивирования микроорганизма

E. Col i>urraMM Н-42, в ферментере емкостью 1500 л, отделяют сепарированием, обрабатывают двумя о объемами ацетона в течение 30 мин при 0-2 С в аппарате, обеспечивающем интенсивное перемешивание суспензии. После отделения ацетона биомассу гомогенизируют в воде, взятой в двукратном количестве по отношению к весу биомассы. Экстракцию фермента ведут при интенсивном перемешивали в течение 1 час, температуре 30 С и рН 6,8-7,0,поддерживаемом l н,уксусной кислотой. Затем суспензию, охлажденную до 4-6 С (при этой температуре ведут все последующие операции), обрабатывают водным раствором полимерного анионита, например поли — 4 — винил — N — бензилтриметиламмонийхлорида, и бесклеточный экстракт отделяют фильтрованием. Получают 5,2 млн. МЕ фсрментативной активности. К экстракту постепенно при леремешивании добавляют ацетон в количестве 0,8 объема по отношению к обрабатываемому раствору и выпавший осадок отделяют сепарированием. Осадок, содержащий 4,7 млн. МЕ L — аспарагиназы с удельной активностью 40 МЕ/Mr белка, растворяют в 0,02 М ацетатном буфере, раствор осветляют и при рН 5,0 добавляют товарный раствор полиэтиленгликоля с мол. в. 1500 до 6%-ной концентрации его в растворе, удаляют вьшавшие балластные белки и концентрацию полиэтилснгликоля в растворе доводят до 9%. При этом выпадает в осадок фракция, содержащая 85% L — аспарагиназной активности обрабатываемого раствора. Удельная активность возрастает до 165 МЕ/мг белка. Наблюдается кристаллизация фермента в форме мелких игольчатых кристаллов. Полученный осадок растворяют в аммонийно-ацетатном буфере (рН 5,0) и фермент осаждают, добавляя 30% (oo/îá) этанола. Кристаллический осадок содержит 80% общей ферментативной активности. Последующую кристаллизацию проводят из того же буфера в присутствии 6Я полиэтиленгликоля. Осадок растворяют в летучем буфере и лиофильно высушивают. Получают около

15 r препарата с удельной активностью 200 МЕ/мг белка, Пр им е р 2. Биомассу Е.Col i, штамм 980, обработанную ацетоном, подвергают водной экстрак5 ции, поддерживая рН7,0-7,2 в течение 1-1,5 час. После обработки суспензии полимерным анионитом ВА-2 получают бесклеточный экстракт с удельной активностью 6,9 МЕ/мг белка и суммарным содержанием L — аспарагиназы 1,8 млн. МЕ. Раствор фер10 мента далее обрабатывают равным объемом ацетона и отделяют выпавший осадок, который представляет собой сырец L— - аспарагиназы с удельной активностью 30 МЕ/мг белка. Выход на данной стадии составляет 1,5 млн. МЕ L— - аспарагиназной активности. Далее очистку ведут по примеру 1.

Пример 3. Осадок фермента, полученный в результате фракционирования по примеру 1, растворяют в аммонийно-ацетатном буфере (рН 5,9), осветляют и фермент осаждают равным объемом

20 этанола. После 2,5 час размешивания в осадок переходит 80% ферментативной активности. В этих условиях осаждения происходит более эффективное отделение пигментов, сопутствующих ферменту на предыдущих стадиях. Далее фермент переосаж25 дают полиэтиленгликолем и доводят до лиофильно высушенного препарата по примеру 1.

Формула изобретения

1, Способ выделения I — аспарагиназы, прсдус30 матривающий отделение оиомассы от ку.—,оr-óðàëüной жидкости, обработку ацетоном для разрушения клеточной оболочки, экстракцию фермента из биомассы, осаждение фермента ацетоном, растворение полученного осадка, осаждение балластных белков

35 из раствора полиэтиленгликолем, осаждение фермента из очищенного раствора полиэтиленгликолем, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, осаждение фермента ацетоном осуществляют

40 при соотношении ацетон: экстракт, равном

0,8 — 1,0:1,0 при рН 5,0 — 7,5, а осаждение фермента из очищенного раствора полиэтиленгликолем осуществляют при рН 5,0 — 5,5, после чего фермент очищают переосаждением этанолом и полиэтиленгликолем.

2. Способ по п.1, о тли ч а ющий ся тем, что пересаждение фермента этанолом и полиэтиленгликолем осуществляют соответственно при рН 5,0-6,0 и рН 5,0-5,5.

50 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Великобритании N 1212136, класс

С 3 Н 3, 1970 (прототип) .