Патент 544385

Способ получения антибиотика 17.967

 

т ЮСЕСаНЕЕНАЛ

УА ЯУ1Г У м " тг У

Фюйэеа фа i&A

ОПИСЛНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 544385 (б1) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 13.05.69 (21) 1330012/13 (23) Приоритет — (32) 13.05.68 (51) М. Кл. С1209/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (31) 151589 (13) Фрипшя д) УДК 615.779.931 (088.8) (43) Опубликовано 25,01.77, БнзллетЕнь ¹ 3 (45) Дата опубликования описания 25.07.77 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Дениз Манси, Леон Нинет и Жан Предом (Франция) Иностранная фирма

"Сосьете Дез Юзин 111нмик Рон-Пуленк" (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНХИБИО ГИКА 17.967 RP

Rp npuИзобретение относится к микробиологической промышленности.

Целью изобретения является получение антибиотика 17.967 ЯРобладающего антнбактериальной активностью по отношению к бактериям различных видов.

Способ получения антибиотика 17.967 RP заключается в том, что штамм !М ер1ои усдб

roseopullatos DS 20,073 (NRRL 3430) культивируют 10 в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с последующим вьщелением и очисткой целевого продукта известными приемами, Продуцент антибиотика 17.967 надлежит к роду Streptomyces.

Streptomyces штамм DS 20.073, образец котороГо описан в коллекции департамента сельского хозяйства в Пиории (США) под номером N RR L 3430 выдеЛен из бразильских почвенных образцов.

Streptomyces roseopuI Iatos штамм DS 20.073 образует короткие скороносящне волокна, закручивающиеся у верхушки в одну или две спирали. Эти спороносцы включаются в волокна воздушного мицелия иногда в виде отдельных волокон, но чаще в виде коротких гроздьев. Споры овальные, их размеры приблизительно 0,4 — 0,6 и

0,6 — 0,8д. Streptomyces roseopullatos штамм

DS 20.073 обладает свойством продуцировать мела ниновый черный пигмент на средах с тирозином, а также на большом наборе различных органическихсред, кроме того он образует растворимый темно — коричневый пигмент на некоторых агаризованных синтетических средах. Цвет спороносящего воздушного мицелня розовый.

Культуральные признаки н биохимические свойства Streptomyces roseopuI latos штамм

DS 20.073 указаны в табл. 1. Эти признаки приведены на стадии нх наибольшего развития после трехнео дельного выдержттвання при 26 С.

544385

Среда дпл культивировани

Разин

Серо-розовый, силь- Желто-коричневый.Спорь» овальные, но раэвитътй переходяший в размером 0,4-0,6 и черный 06 0 S споРоиосцы образуют спирали и располагаются в виде коротких гроздьев

Агар Треенера Хорошее и Хикеи (Л) Субетратнын. коричневато-желтый

Субстратнь»й, желто- ко. рнчнев ый

Розовато — серый, свет- Желто-кори п»евый, пый, средне развитый переходящий в

WpBb»»»

Агар (8) То же

Желто-коричневый, почти коричневый

Розовато-серый, хорошо развить»й

Субстуап»ь»й, желто-коричневый

Агар с дрожжевым зкстрак. том Придхема

Субстратньтй, желто к»ь ричневый

Темно- коричневый, Бельгй с розово-серым, хорошо развитьй

Овсяный агар с томатной пас- — и— тои Придхема (С) Сероватый, умеренно развитый

Субстратньп», коричневочерный

Глюкозопептоиовь»й агар (М/е1

Коричнево-желтый

Нет

Веге»аз»»вный, кори п»евожелтый, умеренно- развиT»«Gl

Пи» ательиый» Умеренное р (а»») Черный, обильный гтбразование мела. продуцируется сра- нина: положитель зу в начале культи- иое виров аиня

Вегетатнвт»ый, черный

Вегетат»»вньй«беснветнь»й желтоватый, умеретп»о рази итьй

Агар с малатом Умеренное кальман««я Кра»»и ского (F) Нет

Агар с яичным Умеренное альбумииом (Wg gа ) Черный достаточно обильный

Серовато-розовый, умеренно развитый

Коричнево-черный

Субстра т1»ь»й, коричневочернь»й

Субстратнъ»й, коричневооранжевый

Серс белый с серорозовым, весьма умеренно развитый

Коричнево-оранжевый, переходящий в коричнево. черный

Агар с тира зи. Средже иом и дроиокеВъ»м зкстрактом для выявления мела тп»н оо6 р а зоватп»»» {E) Глюкозоаспаргиноаьа» агар (W,)

Глииерииоаспаргииовый ааар (А з) Субстратиый, оранжево-ко-Серовато-желтый, рнчневый с коричнево- слегка розовый, черным слабо развитый

Рвстворимость малата кальпия: р»»створяется, но медленно

544385

Продолжение табл.

Наблюдения и биохимические свойства

Серо-коричневатый, Споры овальные рвв слабым мерои 0,4 — 0,6 и

0,6 — 0,8д, спороносцы образуют спирали и располагаются в виде коротких гроздьев крахмала, гидролиэ продолжителъный

Хорошее Субстратиъ1й, коричневожелтый

Розово-сероватый, хорошо развитъгй

Агар с крахмалом и минеральными солями Придхема (G) Гидроли э крахмала положительный

Агар с крахмалом и нитратом (Wi о) Хорошее Субстратный, цвета красного дерева с коричневым, переходящий в коричневочерный

Бело-розовый до се- Черный глубокий ровато- розового, хорошо развитый

Синтетический агар Гауэе (Н) Серовато-белый со светлым сероватожелтым, умеренно развитый

То же Вегетативный,корнчневожелтый

Синтетический агар Чапека с сахарозой (W ) Темно-коричневый

Вегетативиый, коричневожелтый, светлый с темнокоричневым, очень хорошо развитый.

Нет

Пигмент корнчненево-оранжевый

Синтетический агар Чапека с глюкозой (1) Бульон с крахмалом и ннтратом (W») Среднее Покров достаточно хоро- Беловатый весьма Корнчнев жвлтЫ Реакция на ннтриты шо развитый, субстратный, умеренно развитый пол ожителъная желто — коричневый .

Бульон Чапека Умеренное Развивается в виде с сахарозой (W, ) беловатых хлопьев на поверхности и оседает

Бульон Чапека с целлюлозой

Развития не наблюдалось

Утилизация целюлозы отрицателъная

Питательный бульон с нитратами (К) Умеренное Серовато-белый венчик

Темно-коричневый Реакция на нитриты отрицательная в ходе культивирования; пробы брались соответственно через

24 час,43 час, 8 дней, 15 дней и 1 мес. куль тнвирования

Весъма Субстратньш, желтоватый Белый с серовато-бе- Коричневатый умеренное со светло-коричневым лым, умеренно развитый

Реакция на ннтриты слабо положительная в начале культивирования, делается очень быстро отрицатель-ь .ной

11ро 1олж нп бч

Внешний вид воздушного мицелия и спороносцев

Среда для культивирования

Наблюдения и биохимические свойства

Развитие

Мицелий

Пигментация

Черный глубокий

Хорошее

Вегетативный желтовато- серый с коричнево-черным, очень хорошо развитый

К улыи в и рование на картофеле (\627) Серовато-белый с серо- розовым, очень слабо развитый

Чистый 12%ный

/ желатин

Вегетативный„ развивается на поверхности, коричнево-желтый

Хорошее

Нет или серовато-белый в виде следов

Агар Треснера и Данта (М) Вегетативный, черный, хорошо развитый

То же

Нет

Обезжиренное молоко (N) при 25 С

Хорошо развитый венчик

Нет

Полная пептонизация без коагуляции, РН не меняется в течение месяца

Обезжиренное Очень Очень хорошо развитый Нет молоко при хорошее венчик, коричнево-жел37 С TblH

Полная пептоиизация беэ коагуляции, РЯ не меняется в течещи месяца шегося в процессе культивирования продукта.

Культивирование осуществляют любым методом аэробного культивирования, поверхностного или глубйнного, но предпочитают глубинное.

Среда для ферментации должна содержать источники ассимилируемых азота и углерода, минеральные вещества и иногда факторы роста, причем все эти компоненты вводят в виде отдельных веществ или в виде сложных смесей.

В качестве источника ассимилируемого углерода используют такие соединения углерода как глюкоза, мальтоза, декетрин, крахмал или другие органические вещества, например, спирты, глицерин, манонитол или органические кислоты (молочную, лимонную). Некоторые животные и растительные жиры, например, свиной жир или соевое масло, могут заменить эти источники углерода или дополнить их.

Источниками ассимилируе мого азота могут быть минеральные или органические соли аммония, мочевина, некоторые аминокислоты, а также сложные вещества, содержащие азот, главным образом, в белковой форме: казеин, лактальбумин, глютен и их гидролизаты, соевая, арахисовая, рыбная мука, дрожжевой, мясной экстракты, кукуруза, растворимые мелассы.

Добавляют также минеральные вещества, которые обладают буферным или нейтрализующим действием, например фосфаты щелочных или щелочно10,5 кг/л)

=377

ЕД

Минймум поглощения при

285 нм EI%

=281

Максимум поглощения при

368 нм

Е см

= 707

Антибиотик 17.967 RP растворим в диметилформамиде, мало растворим в пиридине, ацетоне, метаноле и воде, нерастворим в эфире, циклогексане и гексане.

S5

Антибиотик 17.967 RP содержит углерод, водород, кислород и азот. Его элементарный состав,%: С вЂ” 61,5; Н вЂ” 5,25; 0 — 20,0; N — 12,5.

Антибиотик представляет собой микрокристал-. лический желтый порошок. Точка плавления 40

290 — 300 С (с разложением).

УФ вЂ” спектр. (раствор в диметилформамиде, концентрация

Максимум поглощения при

268 нм

В растворе д1метилфор1мамида его оптическое б вращение равно (а) о = +103 (С=0,5) .

Способ получения антибиотика 17.967 RP состоит в культивировании Streptomyces roseopu Ratos

DS штамм 20.073 или его мутантов на среде в соответствующих условиях и выделении образовав- бО

Коричнево-желтый Превращение в жи . кос1ь: преврашается, но медленно

ЧеРный глубокий Образование Н $ образуется сразу положительно в начале культивирования

544385

10 земельных металлов ипи карбонаты кальция и магния.

Хлориды и сульфаты щелочных и щелочноземельных металлов обеспечивают ионное равновесие, необходимое для развития Streptomyces roseo.—

pul latus штамм DS 20.073 и образования антибиотика.

Соли цинка, мели, кобальта, марганца действуют как активаторы. рН ферментационной среды в начале культивирования должно быть в пределах 6,0 — 7,8, предпочтительно 6,5 — 7,5. Температура ферментации 25 — 30 С. Аэрация 0,3 — 3 л воздуха на 1 л бульона в 1 мин. Максимальный выход антибиотика 17.967 RP получают через 2--8 дней культивирования.

Антибиотик 17.967 RP выделяют из сусла растворителями, несмешиваюшимися с водой, такими как алифатические спирты, например этипацетат, хлорированные растворители, например дихпорэтан, хлористый метилен или хлороформ.

После фильтрования и декантации сырой продукт выделяют из органических растворов концентрированием этих растворов при пониженном давлении и последующим высаждением каким-либо растворителем, совсем нерастворяющим вещество или плохо его растворяющим, например гексаном.

Грязный антибиотик очищают перекристаллизацией или хроматографией на различных адсорбентах.

Методы экстракции, выделения и очистки антибиотика могут быть повторены многократно с целью выделения этого продукта в форме, пригодной к употреблению.

Пример 1. В ферментер емкостью 350 л загружают 5 кг кукурузы {50%-ный сухой экстракт); 7,5 кг крахмала (частично гидролизованного) водопроводную воду добавляют до 220 л, рН доводят до 6,85 450 мп 10 Н соды. Среду стерпизуют барбатированием нара температуры 122 С в течение 40 мин. После охлаждения объембупьона 250 п и рН 6,85. Затем засеивают 200 мл культивированного s колбе Эрлекмейера с перемешиванием

Streptomyces roseopullatos штамм 0S 20.073

Культура развивается при перемешивании и аэрации стерильным воздухом при 27 С в течение 27 час. После этого она становится пригодной для эасеивания с целью получения антибиотика.

Получение антибиотика производят в ферментере емкостью 800 п, загруженном следующими веществами:

Растворимые мепассы, кг 7,5

Кукуруза (50%-ный сухой экстракт), кг 10

Соевое масло, и,10

Хлорид кобальта гексагидрат, г 10

Водопроводная вода добавляется до, п 450 рН доводится до 7,25 с помошью 1800 мл 10

Н соды)затем добавпяюг 2,5 кг карбоната кальция.

Стерпизуют среду барботированием пара температуры 122 С в течение 40 мин. После охлаждения объем бульона около 490 п. Его доводят ло 500 л добавлением 5 л стерильного водного раствора, содержашего 2,5 кг церелозы и 5 л стерильного водного раствора, содержащего 1 кг сульфата аммония. рН среды тогда становится 7,10.

Затем засевают 40 п инокулята, полученного в ферментере на 350 л как описано вьппе. Культивирование проводят при 27 С в течение 138 ч пои перемешивании с помощью турбины, делающей

175 o6/MèH и аэрации пропусканием стерильного воздуха со скоростью 20 м час, рН среды становит. ся 7,40, а объем сусла 450 и. Количество а1пибиотика 27 ед/см .

Пример 2„450 п сусла для ферментации, полученного в условиях примера 1 и имеющего титр 27 ед/см, помешают в чан, спабженный псремешиваю1цим устройством. рН сусла човолят ло

7200 см 5 Н соляной кислотой. 11обавпяют затем 400 и зтипацетата и перемешиван1г 1 час. Затем добавляют 50 кг вспомогательного агента !uIII фильтрования и суспензию фипьтруюг на фильтре под давлением. Осадок промывают l00 и 3типацетата, а затем 100 п волы. Фи II TpBT н промынные воды, объем которых 1000.1, юкантнруются. Органическую фазу отделяют, се обьсм 390 п. Нижний вошппй спой, обьем которого 610 и, отбрасьпзают, органический экстракт промывают 100 п волы II промытый экстракт отделяют 01 волно1о слоя.

Промытый органический 3Kc1paKI концентрируют при пониженном лав11еппп (30 мм Н g) при 27 С ло объема 3 п.

Концентрат разбаиияют 30 и I I.I.caIIa. Лнтибиогик высаживают, отлелянп фипьтрованпеM. иромыи вают гексаном и суц1аг при 40 С при ион жецном давлении (5 мм Н9) . Попучают таким образом 3 I г грязного 17.967 RP. имеюшего активцость 244 ел/мг.

Пример 3. 47 г продукта, попученцого, как описано в примере 2, расгворяюг прп перемешнванни в 1 и диметипформамила. Полученный раствор фильтруют. Затем медленно добавияют прп перемешивании в течение 4 час 1,5!1 смеoH ме1аноп-вода (50 — 50 об.%), чтобы вызвать кристаллизацию 17.967 RP. Кристаллы фи.1ьтруют, промывают смесью 0.3 и метанол-вода (50 50 об., ) и 0,2 п ацетона, затем высушивают в течение l 5 час при 50 С в вакууме (5 мм Но). Получают 8,7 г кристаллического продукта. имеюшего активность 600 ед/мг.

Пример 4. 8 4 г продукта. полученного по примеру 3. растворяют при перемецшванни в 250 мп диметипформамила. Полученный раствор наносят на хроматографическую к опопку, содержащую 120 г силикагепя Мерка, пропита1шого смесью диметилформамид-ацетон (50--50 об. r). Сипикагель промывают 500 мп смеси лиметнпформамида-ацетон (50 — 50 об.%). K фракции, окрашенной в желтый цвет (прибпизцтспьцо 500 м.1, солержаШей 17.967 RP) лобавпян11 500 мп смеси метанол-вода (50 — 50 об5. :), которая вызывает кристаллизацию 17,967 RP. Кристаллы 41ппьгр н11, промывают 150 мл смеси метаноп-вола (50 50)ц !00 мп

544385

Составитель С. Малютина

Техред 3. Фанта

Редактор A. Бер

Корректор Б. Югас

Заказ 76О/75

Тираж 541 Подписное

ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, >К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

4 аь "4ьц .

11 ацетона. Продукт высушиван т в ьтечер1е 15 час при 50 С в вакууме (5 мм Н g), Таким образом получают 5,74 г 17.967 RP, имеющей активность

880 ел/мг.

1I р и м е р 5, 21,7 г продукта, полученного по примеру 4, растворяют прн перемешивании в

600 мл диметилформамида.

Раствор фильтруют, затем медленно в течение

4 час при медленном перемешивашш прибавляют 1200 мл смеси ацетон-вода (50 — 50 об.%), чтобы вызвать кристаллизацию 17.967 RP, Полученные кристаллы фильтруют, промывают 200 мл смеси ацетон-вода (50-50 об,%) и 200 мл ацетона, высушивают в течение 1S час при 50 С в вакууме (5 мм

Н g), затем в течение 8 час при 50 С при О,S мм Нд.

Получа1от 18,2 r 17,967 RP (чистого), имеющего активность 1000 ед/Ihr.

Приме р6. 20 г продукта, полученного по примеру 2, и имеющего активность 195 ед/мг, растворяют в смеси ацетон-диоксан-вода (10 — 3 — 1 об.%)

Полуюнньпт раствор фильтру1от для отделения 6,5 г нерастворимого осадка. К раствору добавляют 200 г снликагеля Мерка и упаривают досуха на роторе, получая 17.967 RP, нанесенный на снликагель. Готовят колонку из 1 кг силикагеля Мерка с помощью хлороформа (h = 51 см и d = 7 см) и помещают нанесенный на силикагель 17.967 RP на эту колонку. Элюирование проводят последовательно с помощью следующих растворителей: хлороформ-метанол-ацетон (78 — 20 — 2 об%) 4л, ацетон

4 л. Элюагы концентрируются до обьема 100 мл.

Так как в ходе концентрирования 17.967 RP высаживается, добавляют 50 мл диметнлформамида, чтобы растворить этот осадок и сконцечтрнровать снова до 50 мл. Медленно добавляют и течение

1 час 30 мл воды, чтобы вызвать кристаллизацию 17.967 ЙР. Кристаллы фильтруют, промывают 20 мл лттоксана и высупжвают и течение 15 час при 50 С в Вакууме (5 мм Pg). Получают jl,17 r очищенного 17.967 RP, имеющего активность

925 ед/мг.

Антибиотик 17,967 RP обладает антибактериальной активностью по отношению к бактериям различных видов, Он не проявляет заметной перекрестной резистенции с хромомицнном, руфохромомицнном и фуыорубицином и обнаруживает незначительную перекрестную резистенцию с актиномицином.

Антибиотик обладает также бактериостатической активностью по отношению к некоторым возбудителям инфекции. Кроме бактериостатической активности антибиотик обладает антиопухолевой активностью при введении его под кожу или внутрибрюшинно. Эту активность определяют на опухолях, привитых мышам, таких как, саркома 180 (твердая форма), асцидные клетки Эрлиха и лейкемия L 1210, при дозах в пределах 0,2 — 0,005 мг/кг.

При саркоме 180 у мышей подкожное введение дозы 005 мг/кг в день в течение 5 дней вызывает уменьшение веса опухолей по отношению к весу опухолей у контрольных животных на 80%.

Токсичность антибиотика определяют на мышах при введении им дозы вещества подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или перорально в течение 5 дней подряд. Лд>о, определенные для подкожного введения 15,000 мг/кг, внутрибрюшинного—

0,055 мг/кг, внутривенного — 0,150 — 0,175 мг/кг.

Формула изобретения

Способ получения антибиотика, о т л и ч а ющи и с я тем, no штамм Streptomyces roseopuj1атов DS 20.073 (N-Яйся 3430) культивируют в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта известными приемами.