Способ получения нерастворимого комплекса пенициллинамидазы путем связывания фермента с ионитом

Патент 547113

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОП ИСАНИЙ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

И А®ТОРСКОММ СЮН ВТМЬС(В3

Своа Соееюех

Социалистииесюа ресаубймм (6() Лополмнтельное. к авт, свил ву(ЯЯ) 3aaspego 2 3.01.75(Я)2 10031 5/1 3 е арнеоединеннем эанакн М (2З) Прмормтет(43) Олублмковано25,09,77,Бюллетень %35 (46) Дата опубликования опнсанна25.10.77 (ЬЦ X. K, С 12 Р 13/10 : 07 7/02 (5З) УДК615,779.94 (088,8) П, С, Ныс, Е. М, Савицкая, Т, С, Колыгмна, H. Н, Шелленберг, В, К, Антонов и Л, В, Козлов (Щ Аэт4фм маобре таама

Всесоюзный научно-исследовательский и титут антибиотиков (Щ Зайэатель (54} СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕРАСТВОРИМОГО КОМПЛЕКСА

ПЕНИЦИЛЛИНАМИДАЗЫ

Изобретение относится к получению нерастворимых в воде ферментных препаратов.

Известен сиособ получения нерастворимого фермента; наиример пеииииллинамидаэы (ПА), заключающийся в том, что нерастверимый носитель обрабатывают ароматическими соединениями, содержащими аэпаиые или триазильюяе группы, в частности аминодихлор-симы-триазином, после чего фермент ковалент ио связывают при пропускаиии чвпвз колозку с модифицированным носителем(Х).

Известен также способ получения иммобилизованной пеинциллинамидазы (ИПА) путем сорбцим (ПА) иа носителях азной арароды с носледуюшим ковалеитным связыванием сорбированной ПА и носителя при помощи функционального реагента - глутарового аль дегида (21.

Недостатком этих способов является ие- gp высокая эффективность связывания, а также низкая удельная активность и стабильность комплекса.

Белью изобретения является повышение эффектмвносхм связывания, удельной актив2 ности и стабильности комплвкса, Эта цель достигается тем, что фермент компенсируют с водорастворимым полипикличвским ароматическим соединением, а затем сорбируют на аммоните.

Способ осушес.твляют слвдуюшим образом, Вначале проводят ковалентное связывание

ПА с низкомолекулярным ароматическим соединением, содержашмм, помимо гидрофобных и смльнокислых, также реакционноспособные группы, лри рН 7,0, ионной силе 0,1 M u о температуре 28 С в течение 2 ч. Затем не вступившее в реакцию низкомолекулярное соединение отделяют от модифицированной пенмимллинамидаэы (МПА) на колонке с сефадексом Q -25, уравновешенным 0,01 М фосфатом буфером, рН- 7,5. Условия связывания обеспечивают " 100%-ное сохранение активности фермента.

Полученную МПА сорбируют ионитами, предпочтительно макроаористыми анионитамм при рН-7,5 и 0,01 М ионной силе в течение 24 ч при перемешиваним и температуре -5 С. Полученную ИПА отделяют фильт5471 1,3 к активности, взятой на связывание, равеЪ;

61%. Для получения ИПА была снята зависнмооть максимальной скорости реакции от рН в интервале рН S,S-8,5. Максимум катвлитической активности ИПА находится в интервале рН 6,5-6,7, что на единицу рН кислее, чем соответствующий интервал рН для нативного фермента (рН 7,5-7,8). Время йолураспада полученной ИПА в максимуме ее каталитической активности {pH-6,5) равна 740 ч, что в . 10разбольшевремени полураспада соответствующего нативного фермента в максимуме его активности.

Пример 3. Получение 6-аминопенциллановой кислоты (6-ЛПК).

5 r ИПА с активностью 6200 ед/г влажной ИПА (влажность 54%) инкубируют в течение 240 мин с 4 г К-соли бенэилп нндиллина (10,7 м моля s 80 мл дистиллированной воды при 20 С и автоматическом поддержании рН 6,5 25%-иым раствором аммиака в; реакторе периодического действия. После отделения фермента получают

80 мл раствора с концентрацией 6-АПК

0,119 ммоль/мл. Раствор охлаждают до

5-6 С и обрабатывают 1% (rto объему) ако чивированного угля. 1(елевой продукт выделяют иэ раствора при установлении рН

3,8-4,1, Кристаллический осадок фильтруют, промывают и cymar. Получают 1,67 г

6-АПК с содержанием 95%. ИммобилиэованЮ ный фермент снова инкубируют с 4 г К-соли бенэилпенициллина в 80 мл дистиллиро-. ванной воды и выделяют целевой продукт, как описано выше. Операцию повторяют до .

100 раэ и более. Выход целевого продукта после проведения 100 операций составляет

80 5% от теоретического, чистота 6-AllK96,5%, В соответствии с методикой, описанной в примере 1, была произведена модификация ПА рядом соединений, отличающихся природой реакционноспособных и ароматических групп (ядра бензола, нафталина, внтрахинола), а также количеством ионогениых групп. Последующую сорбцию полученных ,препаратов модифицированной ПА анионитом

Амберлитом дМА -938 и дальнейшую обработку полученной РПА йроводят, как описано выше, Способ получения нерастворимого комплекса пенициллинамидвэы путем связывания фермента с испитом, о т л и ч в ю щ и йс я тем, что, с целью повышения эффективности связывания, удельной активности и стабильности комплекса, фермент предвврацией, суепендируют в 1 М аСИ (перемешиванае 2 ч, температура -5 С) для элюции непрочно связанного фермента. и промывают водой.

Получают ИПЛ с активностью до 6000ед/г а влажного носителя при выходе активности до 60%.

Пример 1. Модификация (ПА).

200 г леофильно высушенного Ърепарата ПА с общей активностью 800 ° 10 ед. щ .

ПЛ, удельной активностью 20 ° 10 ед/мг

Э белка и 45 мг ярко-голубого активного дихлортриазинового красителя растворяют в 15 мл 0,2 М фосфорного буфера, рН-7,S.

Раствор выдерживают s течвжв 2 ч при 15 о

28 С,. а затем отделяют избыток несвязавшегося красителя на колонке с сефвдексом

4 -25. Объем колонки 60 мл, навесив сефадекса 17,0 г. Перед заполнением колонки сефадексу дают набухнуть в 0,01 М 20 фосфатном буфере, рН -7,5. На колонку с сефадексом наносят 14,7 мл раствора, содержащего модифицированную ПА и избыток красителя. МПА влюируют 0,01 М буфером, рН-7,5 и получают 25 мл раствора МПА 5 с общим содержанием фермента 78,0 10 ед.

ПА, т.е. 98% от активности, взятой нв связывание. Содержание коввлентно связан ного красителя оцределяют спектрофотомеч;. рически, оно составляет 6I0 10 М. 30

Пример 2. Иммобилизвция ПА.

К 1,0 внионита Амберлит 33А -938 (сильноосновный анионит на основе стиролдивинилбенэола), эернение 0,25-0,5 мм, который. предварительно был приведен в равновесие с 0,01 М фосфатным буфером, рН-7,5, добавляют 3 мл раствора модифицированной ПА, приготовленной в соответствии с примером 1 (МПА), и 17 мл

0,01 М фосфвтного буфера рН-7,5. Общее 40 содержание мента, взятого на сорбцию, равно 9,3 10 ед. ПА. Сорбцию ведут в . о течение 1 сут при перемешиввнии при -5 С, Полученную ИПА заливают 20 мл 1 М КаСР и десорбируют несвяэавшуюся ПА при перео мешивании в течение 1 ч(-5 С, операцию проводят дважды). Затем ИПА промывают

0,1 М фосфатным буфером (рН-7,5) и водой. Ферментвтивную активность определяют в условиях, описанных для нвтивной ПА.

Получают 0,91 ". ферментного препарата с активностью 6 00 ea/г влажной ИПА (Я Е, ИПА). Эффективность связывания, равная отношению выделяемой активности ИПА к теоретически ожидаемой, которая определяет. ся по разности между активностью, взятой нв связывание, и активностью в фильтрвте, элюатвх и промывках, составляет 68%. Общий выход активности ИПА, представляющий отношение выявляемой активности ИПА

Формула изобретения

547113

Составитель С. Малютина

Рвпвктоо Г. Дввятко Текреп н. Аепрепчук Корректор А. Кравчевкт

Звяке 8801/46 Ткрвж 84 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская Наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 рительно конденсируют с водорастворимым полициклическим ароматическим соединением, а затем сорбируют на анионите.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе;

1. Патент Великобритании 1302706, Кл. С 3 Н, 1959.