Способ диагностики туберкулеза

Способ диагностики туберкулеза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

пц 552ОУ4

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик л ,1 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 20.05.75 (21) 2135690/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 30,03.77. Бюллетень № 12

Дата опубликования описания 15.04.77 (51) М. Кл.2 А 61B 10/00

G 01N 33/16

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК 616-002.5-07 (088.8) (72) Авторы изобретения

А. Е. Рабухин, М. М. Авербах, В. И. Литвинов, В. Я. Гергерт, А. С. Борзенко и Т. И. Виноградова (71) Заявитель

Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к иммунологическим способам определения минимальной активности туберкулеза.

Среди иммунологических способов известен способ реакции торможения миграции.

Способ основан на феномене торможения миграции клеток in vitvo (макрофагов, лейкоцитов), полученных от животного или человека и помещенных в стеклянные капилляры и питательную среду со специфическим антигеном. Необходимым условием является то, чтобы организм животного или человека был сенсибилизирован (иммунизирован) этим антигеном.

Известен также способ определения активности туберкулезного процесса, заключающийся в том, что проводят реакцию торможения туберкулином миграции лейкоцитов крови больного.

Однако известные способы не обеспечивают высокой точности диагностики.

С целью повышения точности диагностики после определения степени торможения миграции лейкоцитов пациенту вводят туберкулин, повторно определяют степень торможения миграции и сравнивают показатели.

Способ осуществляют следующим образом.

Реакцию ставят с лейкоцитами периферической крови больного туберкулезом.

Кровь забирают из локтевой вены сухим стерильным шприцем в количестве 10 — 12 мл и переносят возле пламени горелки в стерильную двадцатимиллилитровую пробирку, в ко5 торую предварительно помещают растворенный в 0,5 мл питательной среды гепарин (сухой СПОФА или жидкий Гедеон-Рихтер) в таком количестве, чтобы обеспечить конечную концентрацию 25 единиц гипарина на 1 мл

10 крови. Кровь быстро перемешивают с гепарином для предупреждения свертывания, затем (все дальнейшие процедуры проводят в стерильном боксе со стерильной посудой) в нее добавляют 0,6 — 0,7 мл стерильной 10%-ной

15 желатины, вновь перемешивают пастеровской пипеткой и ставят в термостат при 37"С на

25 — 30 мин для отстаивания эритроцитов. Забирают весь слой плазмы с лейкоцитами в охлажденную стерильную центрифужную про20 бирку объемом в 10 мл. Пробирку с плазмой центрифугируют при 1000 об/мин в течение

10 мин. Плазму сливают, клеточный осадок взвешивают B 5,0 мл гипотонического раствора (0,35%) NaC1 для лизированпя оставшихся

25 эритроцитов и пппетизируют в течение 30—

40 сек. Затем в смесь быстро добавляют 0,6 мл

5 /О-ного раствора NaC1, в результате чего раствор становится изотонпчным. Смесь в этой же пробирке вновь центрпфугируют при

ЗО тех же режимах, надосадок опять сливают и к

552074 осадку добавляют питательную среду № 199 в количестве 5,0 — 6,0 мл, в которой осадок взвешивают пастеровской пипеткой (эта процедура служит для отмывания клеток). Смесь ,вновь центрифугируют при тех же режимах.

Последний этап с взвешиванием в среде № 199 для тех же целей повторяют еще раз. Затем надосадок сливают, а оставшийся клеточный осадок осторожно размешивают в оставленной капле среды стеклянным капилляром (с внутренним сечением 1,0 — 1,2 мм и длиной

15 см) и набирают в эти стеклянные капилляры (примерно до половины их длины). Количество капилляров зависит от величины клеточного осадка. Свободный (незаполненный) конец капилляра расплавляют в пламени горелки (на расстоянии 1,0 см от границы клеток) и запаивают. Капилляры запаянным концом вниз помещают в стерильные сухие центрифужные пробирки и центрифугируют при 700 об/мин в течение 5 мин. В это время готовят камеры, в,которые затем будут помещены капилляры. Камеры представляют из себя кольца из органического стекла с внутренним диаметром 1,6 — 1,8 см и высотой стенки

0,8 — 1,0 см. Эти кольца (по 8 штук) плашмя наклеивают на стеклянную пластинку (размером 9,0)(12,0 см) смесью расплавленных парафина с воском (4 части парафина +1 часть воска) таким образом, что стеклянная пластинка служит дном вновь образованных камер. После застывания смеси парафина с воском кольца оказываются прочно приклеенными.

После центрифугирования:капилляров клетки располагаются внизу, у запаянного конца капилляров, в виде осадка. Прокаленным на огне резачком отрезают точно на границе осадка с жидкостью часть капилляра с осадком клеток (остальную часть выбрасывают) и нарезают на кусочки длиной 0,7 см, которые помещают на дно приготовленных камер так, чтобы один конец кусочка соприкасался со стеной камеры (его приклеивают к ней указанной смесью парафина с воском), а другой свободно смотрел в середину камеры. Камеру тут же заливают 1,5 мл культуральной жидкости (смесью среды № 199 и сыворотки крупного рогатого скота при соотношении

4: 1). Обычно в такую камеру помещают два кусочка капилляра с клеточным осадком. Аналогичных камер может быть две-три. Описанные камеры представляют собой контроль реакции, где клетки в дальнейшем свободно мигрируют по дну камеры, образуя хорошо заметный венчик (зону) миграции на прозрачном стекле, служащим дном камеры. В опытные варианты реакции (две-три камеры) с такими же кусочками капилляров, содержащими испытуемые клетки, вносят такое же количество культуральной жидкости, включающей еще и разведенный туберкулин (PPD-L, сухой, лиофилизированный, Ленинградский) в соответствующей концентрации (1: 100). Все камеры сверху закрывают покровными тонкими

65

55 стеклышками размером 18,0+18,0 мм, которые приклеивают к верхним краям камер стерильным вазелином. После этого камеры помещают в термостат при 37 С на 1 сутки. За это время клетки из капилляров мигрируют по стеклу (дну камеры) .

Положительным результатом реакции считается тот, при котором в опытных камерах, содержащих туберкулин, зона миграции клеток меньше, чем в контрольных, не содержащих туберкулин. Для регистрации результата высчитывается индекс реакции (I).

Для этого вытаскивают камеры из термостата (через сутки после постановки реакции), снимают покровные стекла и помещают камеры в фотоувеличитель (на место рамки с негативом), так чтобы камера и зона миграции клеток проецировалась на стол, на бумагу.

Все зоны миграции зарисовывают на бумагу и шифруют. После этого их переносят на стандартную засвеченную фотопленку, кусочки фотопленки с зоной миграции вырезают (по краям проецируемой зоны миграции) и взвешивают в две порции отдельно: контроли и опыты. После чего высчитывают индекс реакции по формуле: у 0

Рк где Po — вес кусочков пленок с зоной миграции из опытных камер, PÄ Ä— вес кусочков пленок с зоной миграции из контрольных камер.

Если индекс равен 1,0, следовательно, торможения миграции клеток в опытных камерах, содержащих туберкулин, не произошло;

Чем меньше индекс, тем выраженнее задержка миграции в опыте.

Наиболее низкие индексом реакции получаются у больных явно активным туберкулезом в фазе вспышки (обострения) процесса. По мере лечения и рассасывания туберкулезных поражений индекс повышается и становится близким к 1,0, т. е. реакция становится отрицательной. При нормальном разбросе вариационного ряда показателей (индексов) реакций торможения миграции у здоровых людей, при 95% вероятности статистического обсчета; индекс может считаться сниженным (положительная реакция), у больных же туберкулезом (по отношению к здоровой группе людей)— если он (индекс) равен 0,8 и ниже. При лечении туберкулеза реакция становится отрицательной (индекс 0,8 и выше) уже тогда, когда активность болезни еще сохранена по клиническим данным. Таким образом, недостатком описаннои реакции является непригодность ее при малых формах туберкулеза с минимальной (скрытой) активностью.

С целью повышения точности диагностики описанную выше модифицированную методику реакции торможения миграции дополняют следующими моментами: реакцию ставят двукратно, а после первой постановки больному туберкулезом вводят подкожно 20 — 50 ТЕ

552074

Составитель С. Малютина

Техред А. Овчинникова Корректор И. Позняковская

Редактор М. Дмитриева

Заказ 760/2 Изд. Мз 329 Тираж 654 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7Ê-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Б (международных единиц) туберкулина в зависимости от возраста (20 TE — детям и подросткам, 50 ТŠ— взрослым) . Через 48 час после введения туберкулина у больного вновь забирают из вены кровь и реакция торможения миграции ставится повторно. При чтении результатов увеличивается разница между показателями первичной и повторной постановок реакции, Учет результатов при двукратной постановке модифицированной реакции торможения миграции производят следующим способом, Диагноз наличия даже минимальной активности туберкулеза (обследовано 127 человек активным туберкулезом и с неактивными туберкулезными изменениями в легких) ставился при переходе реакции из отрицательной (индекс 0,8 и выше) в положительную (индекс ниже 0,8), причем разница между показателями должна быть не менее 0,1.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую

5 эффективность диагностики минимальной активности туберкулеза (до 92,3%) и имеет большое практическое значение.

Формула изобретения

10 Способ диагностики туберкулеза по торможению туберкулином миграции лейкоцитов крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики, после определения степени торможения миграции лейко15 цитов пациенту вводят туберкулин, повторно определяют степень торможения миграции и сравнивают показатели,