Способ выделения -аспарагиназы
Патент 552355
Авторы
Способ выделения -аспарагиназы
Иллюстрации
Реферат
О П п11 552355 (. оюз Советских
Социалистических
Республик
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 02.07.73 (21) 1942349/13 с присоединением заявки Ме (23) Приоритет
Опубликовано 30.03.77. Бюллетень Ме 12
Дата опубликования описания 24.06.77 (51) М. Кл 2 С 120 13/10
С 07G 7/02
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретения
Р. А. Жагат, Г. И. Клейнер, Д, Я. Дайя, Л. В. Пояркова и В. Я. Штамер
Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза АН Латвийской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ L-АСПАРАГИНАЗЫ
Изобретение относится к способам получения фермента 1-аспарагиназы, используемого в медицине для лечения злокачественных новообразований, особенно лейкозов, а именно к способам выделения этого фермента из клеток микроорганизмов.
Известны различные способы выделения 1аспарагиназы из клеток микроорганизмов, например Escherichia coli. Так, в частности, известен способ, предусматривающий обработку биомассы микроорганизма ацетоном, сушку и извлечение фермента из сухого ацетонового порошка водой. Полученный экстракт подкисляют до рН 4,0 — 4,5 и выпавший осадок примесей отделяют, например, центрифугированием. После этого к раствору фермента добавляют сульфат аммония до насыщения 40—
50 /0, подвергают термической обработке при
55 С и выпавший осадок примесей отделяют, например, фильгрованием или центрифугированием. К раствору фермента добавляют сульфат аммония почти до полного насыщения, выпавший осадок фермента отделяют центрифугированием, растворяют в буфере.
Получают раствор фермента с активностью
26 МЕ/мг и выходом 75%.
Таким образом, получение ацетонового порошка биомассы связано с применением значительного количества огневзрывоопасного пастворителя — ацетона. Обработка биомассы ацетоном и сушка ее в промышленных масштабах — процесс опасный, вредный и неэкономичный. Процесс выделения фермента трудоемок, а эффективность его,незначнтель5 на. Известный способ неэкономичен.
Применение сульфата аммония для фракционирования фермента из слабых растворов также нежелательно, так как требует значительного расхода реагента, который затем не
10 регенерируется. Сбрасывание такого отхода в водоемы запрещено.
Цель изобретения — повысить чистоту и выход фермента.
15 Для этого в качестве органического растворителя используют изопропиловый спирт и обработку биомассы ведут при соотношении компонентов от 1: 4 до 1: 8 при 0 — 20 С, в качестве стабилизатора используют аспарагино20 вую кислоту в концентрации 0,005—
0,015 моль/л, а после удаления осадка балластных белков раствор концентрируют в вакууме при 20 — 25 С и осаждение 1-аспарагпназы осуществляют из концентрированного
25 раствора добавлением безводного изопропилового спирта в количестве 1,0 — 2,0 объема на количество раствора.
Фермент, получающийся по предлагаемому способу, содержит до 120 МЕ/мг белка, что
30 значительно упрощает получение лекарственСоставитель H. Андреева
Техред А. Овчинникова Корректор О. Тюрина
Редактор М. Дмитриева
Заказ 903,7 Изд. й1в 32G Тпрагк 589 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4 5
Типография, пр. Сапунова, 2 ной формы, а выход от исходной биомассы превышает 50 /о.
Предлагаемый способ состоит в следующем.
Биомассу микроорганизма обрабатывают изопропиловым спиртом в соотношении от
1: 4 до 1: 8, растворптель отделяют, например, центрифугированием, фермент извлекают водой. Ввиду присутствия в растворителе изопропилового спирта значйтельная часть белков и других примесей остается в осадке. Для дальнейшей очистки экстракт подкисляют уксусной кислотой до рН 4,5 — 5,0, инкубируют при 50 С, добавив для стабилизации аспарагиновую кислоту в концентрации 0,005—
0,015 моль/л, и, отделив неактивный осадок, например, центрифугированием, концентрируют раствор в вакууме, после чего осаждают активную фракцию 1 — 2 объемами изопропилового спирта. Изопропиловый спирт, отделяемый после обработки биомассы н из маточника после осаждения фермента, может быть регенерирован ректификацией и повторно использован в производстве.
Пример. 15,6 кг бактериальной массы, полученной сепарирован нем культур альной жидкости Езсйег1сЫа со11 на сепараторе с влажностью 85 /о, содержащей 810 МЕ аспарагиназы в 1 r сухого вещества (всего 1,87.
° 10в МЕ при удельной активности 1,2 ME/÷ã белка), загрузили в аппарат с мешалкой и при 10 С обработали 90 л изопропилового спирта. После отделения растворителя на суперцентрифуге получили 7,1 кг биомассы, содержащей 28,3 /o сухого вещества, 52,7 jo изопропилового спирта и 250 МЕ/г биомассы. Выход 95,0% от содержания фермента в биомассе.
Спиртовую биомассу, содержащую 28,3% сухого вещества, загрузили в аппарат с мешалкой и обработали 40 л дистиллированной воды при комнатной температуре. жидкость отделили от осадка на шестикамерном сепараторе. Получили 39,7 л водно-спиртового экстракта, содержащего 40 МЕ фермента в мл. Удельная активность 7,0 MME/мг белка.
Выход 85,0 /о от содержания фермента в биомассе.
Экстракт загрузили в аппарат с мешалкой, добавили 52,8 r аспарагиновой кислоты, подкисличн раствор 2 M раствором .уксусной кислоты до рН 4,7, нагрели до 50 С, выдержали при этой температуре в течение 30мнп, охладили жидкость до 7 С и выдержали в течение 30 мин. Осадок отделили от жидкости с помощью суперцентрифуги, и довели рН раствора до 5,5 — 5,0 М раствором СаОН. Получили 38,8 л раствора, содержащего
37 ME/мл, удельная активность 23 ME/мг
1) белка. Выход 76,5 / от содержания фермента в биомассе.
Ферментный раствор упарили на циркуляционной вакуум-выпа рной установке при остаточном давлении 25 — 30 мм рт. ст. и темпера15 туре в парах 25 — 30 С до 11,9 л.
Концентрат загрузили в аппарат с мешалкой, дооавили при 20 С 17,7 л изопропилового спирта, выпавший осадок отделили от хкидкости на трубчатой суперцентрифуге и раство21 рили в 500 мл дистиллированной воды. Получили раствор аспарагиназы, содержащий
2300 МЕ/мл с удельной активностью
110 МЕ/мг белка. Выход 61,5% от содерл<ания фермента в исходной биомассе.
Формула изобретения
Способ выделения 1-аспарагиназы из биомассы микроорганизма, например Escherichia
coli, предусматривающий обработку биомас30 сы органическим растворителем, экстракцию образующегося осадка водой, подкисление . экстракта, например уксусной кислотой, добавление к нему стабилизатора 1-аспарагиназы, нагревание полученного раствора, удале35 ние выпавшего осадка балластных белков и осаждение из раствора 1-аспарагиназы, отл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чистоты и выхода фермента, в качестве органического растворителя используют изопро40 пиловый спирт н обработку биомассы ведут при соотношении компонентов от 1: 4 до 1: 8 при 0 — 20 С, в качестве стабилизатора используют аспарагиновую кислоту в концентрации 0,005 — 0,015 моль/л, а после удаления
45 осадка балластных белков раствор концентрируют в вакууме при 20 — 25 С и осаждение 1аспарагиназы осуществляют из концентрированного раствора добавлением безводного изопропилового спирта в количестве 1,0 — 2.0
50 объема на количество раствора.