Патент 552906

Способ получения сиродесминов , ,

 

ю

° ° ч1: 4чОО

„вйЬА

ОПИСАН И Е пц 552906

Саюз Советских

Социалистических

Республик изоьеитиния

И ПА7ЕНту (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 05.02.75 (21) 1957518, 2103969/13 (23) Приоритет 13.09.73 (32) 14.09.72 (31) 42694/72 (33) Великобритания

Опубликовано 30.03.77. Бюллетень № 12

Дата опубликования описания 24.06.77 (51) М. Кл. С 12D 9/04

Государственный комитет

Совета Министров СССР ло делам изобретений и открытий (53) УДК 615,779.932 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Дуглас Бродбент, Гарольд Джордж Хемминг и Барри Хесн (Великобритания) (71) Заявитель

Иностранная фирма

«Им ериал Кемикал Индастриз Лимитед» (Великобритания) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИРОДЕСМИНОВ А, G, 1

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способу получения нового антивирусного комплекса.

Описания способа получения препаратов с использованием культуры Sirodesmium diversum в доступной специальной и патентной литературе не обнаружено.

Способ получения сиродесминов А, G,I заключается в том, что штамм Sirodesmium di-, versum С.М.1. 102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, экстрагируют фильтрат культуральной жидкости органическим растворителем, несмешивающимся с водой, выпаривают экстракт досуха, обрабатывают двуокисью серы в органическом основании и разделяют комплекс при необходимости на компоненты.

Подходящим штаммом для получения:сиродесминов является штамм Sirodesmium diversum, полученный в Государственном микологическом институте, находящемся в Ферри

Лейн, Кью, Англия за номером С.М.1. 102519.

Культура хорошо произрастает на обычной агаровой среде, и через 6 дней в колонии образуется центральный участок спорообразующего мицелия, окруженный зоной гиф, которая может быть как воздушной, так и погруженной. Эта зона неокрашена. Спорообразующая область обычно темно-коричневого цвета с несущими споры клетками, возникающими при росте на агаре или на воздухе.

Споры, образующиеся из неспециализированных ветвей конидиофоры видны в длинных, 5 редко разветвленных цепях. Они представляют собой амероспоры и дидимоспоры, развивающиеся от вершины к основанию.

Зрелые споры имеют грубые коричневожелтые клеточные стенки, обычно довольно

10 толстые, но местами тонкие. Амероспоры шарообразные, дидимоспоры почти цилиндрические с сужением около перегородки.

Источником усвояемого углерода являются, например, многоатомные спирты — сахароза, 15 глюкоза, лактоза, глицерин или маннит; источник полимеризуемого углерода, например, крахмал, природные или синтетические масла .или жиры, или смеси двух или более веществ.

Источник углерода содержится в среде в

20 количестве от 0,1 до 30% по весу, предпочтительно в пределах от 2 до 8% по весу.

Источником усвояемого азота являются вещества органического или неорганического происхождения. Они могут быть в форме нит25 рата щелочного или щелочноземельного металла или аммонийной соли неорганической или органической кислоты, например, нитрата натрия, калия, кальция или аммония, тартрата аммония, сульфата аммония или фосфата

552906 аммония, Они могут быть и в форме аминокислоты, например, глицина, в форме муки из семян хлопчатника или жидкости моченой кукурузы, пептона, мочевины, дрожжевого экстракта или мясного экстракта. Можно использовать смеси двух или более указанных веществ.

Источник азота содержится в среде в количестве от 0;001 до 1,0о/о.

В среде могут быть такие элементы, как фосфор, в виде первичного кислого фосфата калия или вторичного кислого ф осфата аммония, магний в виде сульфата или карбоната магния, сера в виде сульфата и калий в виде хлорида или карбоната калия и микроэлементы — железо, марганец, цинк, молибден и медь.

В качестве водной питательной среды используют среду Чапек-Докс.

Культивирование организма осуществляют при температуре от 15 до 35 С, предпочтительно при температуре 25 С.

В качестве несмешивающегося с водой органического растворителя используют хлороформ, этилацетат, толуол или диэтиловый эфир.

Антивирусный комплекс включает восемь соединений, обладающих способностью задерживать рост вирусов и идентифицированных как сиродесмины А, В, С, Д, Е, F, G и Н.

При обработке комплекса, задер;кивающего рост вирусов, двуокисью серы образуется соединение, обладающее тем же свойством, что и сиродесмин 1.

Сиродесмины Л, G, 1 имеют следующие характеристики.

Сиродесмин Л, Молекулярная формула

C oHaoNzOaSz.

Найдено, /о. .С 49,7; Н 5,4; N 5,8; S 12,8.

Вычислено, /о .. С 49,7; Н 5,4; И 5,8; $13,2.

Масс-спектр. Отсутствует исходный ион, но имеется сильный пик при (М вЂ” S>) — . Найдено (+)

m/e 422, 1731; С оН оХоОо требует т/е 422, 1689.

При силировании триметилсилилмидазолом (бензол, 60 С, 3 час) образуется бис-триметилсилилпроизводное.

В масс-спектре этого производного отсутствует исходный ион, но виден слабый пик, соответствующий (M — СНЗ) — при m/е 615, (+)

1689; Cg5H39N OoS Si требует т/е 615, 1686.

Лцетилировачие. При обработке сиродесмина А уксусным ангидридом в пиридине в течение недели при температуре 22 С получается бисацетат с температурой плавления 186—

189 С.

Найдено, /о.. С 50,5; Н 5,3; N 4,9.

С Ноо1Ч О о$ требует С 50,7; Н 5,2, К 4,9о/о.

Наибольший пик масс-спектра (М вЂ” $2) (+) при m/e 506, 1871; С 4НзоЬ401о требует m/å

506, 1901, При обработке сиродесмина А уксусным ангидридом в течение одного часа при температуре 22 С получается моноацетат.

Найдено, : С 49,9; Н 5,3; N 5,3; S 11,7.

С22Н 8Х20оS2требует С 50,0, Н 5,2, N 5,2, 5 $12о/ .

На масс-спектре виден небольшой пик для (М вЂ” S) при т/е 496 и сильный пик для (М вЂ” S ) - при т/е 464. (+)

При гидролизе сиродесмина А 0,1 н. раствором НС1 в метаноле получается дезацетилсиродесмин А с температурой плавления

198 †2 С.

Найдено, /о. С 48,4; Н 5,6; N 6,0; S 14,3.

С1>H>4N>O>$> треоует С 48,8, Н 5,6, N 6,3, S 14,4 /о.

В масс-спектре отсутствует ион, но виден сильный пик для (М вЂ” $ ) - при т/е 380. (:-)

При обработке сиродесмина Л трифенилфосфином в хлороформе получается моносульфид.

Найдено, /о.. С 52,7; Н 5,7; N 5,8; S 7,1.

С оН оN OSSтребует С 52,,9,,Н 5,8, М 6,2, $7,0 /о.

Молекулярный ион виден при т/е 454.

Сиродесмин G. Молекулярная формула

С20Н26И208$2.

Найдено, /о.. С 49,7; Н 5,4; N 5,7; S 12,6.

30 Вычислено, /о. С 494; Н 54; N 58; S 132.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М вЂ” Sz) — при m/е

С)

422.

Гидролиз. При обработке сиродесмина G

0,1 н. раствором НС1 в метаноле образуется дезацетилсиродесмин G, т. плавления 195—

196,5 С.

Найдено, /о. С 48,4; Н 5,5; N 6,5; S 14,6.

Вычислено (о/о) для C)sHz4NzOzSz .С 48,8;

Н 5,5;,N 6,3; S 14,4.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М вЂ” Sg) — при m/å

380.

45 Ацетилирование. При обработке сиродесмина G уксусным ангидридом в пиридине в течение 9 дней при окружающей температуре образуется бисацетат сиродесмина G с температурой плавления 159 — 159,5 С.

50 Сиродесмин 1. Молекулярная формула

Си%6% -4$ .

Найдено, : С 49,8; Н 5,5; N 5,5.

Вычислено, /о. С 49,4; Н 5,4; N 5,8.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но

55 . (+) виден сильный пик для (М вЂ” Sz) — при m/е

422 и слабый пик для (М вЂ” S) — при m/е 454. (+)

Си родесми на А1, G, 1 разделяют методом хроматографии в тонком слое на силикагеле.

После проявления пластины опрыскивают раствором хромовой кислоты и нагревают; вначале появляются желтые пятна, а затем черные. При применении трех разных раст65 ворителей получают следующие величины Ру.

Сиродесмин А: 0,23 (толуол — этилацетат, 1: 2), 0,35 (хлороформ — метанол — муравьиная кислота, 95; 4: 1), 0,19 (хлороформ — этилацетат, 1:1); сиродесмин G: 0,38 (толуол — этилацетат, 1: 2), 0,39 (хлороформ — метанол — муравьиная кислота, 95: 4: 1), 0,32 (хлороформ — этилацетат, 1:1); сиродесмин I: 0,38 (толуол — этилацетат, 1: 2), 0,35 (хлороформ †метанол †муравь кислота, 95: 4: 1), 0,28 (хлороформ †этилацетат, 1:2).

Сиродесмины легче всего идентифицировать при исследовании их спектров ядерного магнитного резонанса.

Инфракрасные спектры сиродесминов очень похожи один на другой.

Комплекс, получаемый при экстракции грибкового бульона, и выделяемые из него новые соединения — сиродесмины А, В, С, Д, Е, F, G, I, дезацетилпроизводные сиродесминов А и G, моноацетат сиродесмина А и моносульфид сиродесмина все обладают способностью задерживать рост вирусов в присутствии клеток хозяина и обладают активностью в отношении риновирусов в присутствии эмбриональных легочных клеток человека, а также в отношении вирусов Кокссаки А и В и Эко-вирусов.

Активность в отношении риновирусов измеряют следующим образом.

Легочные эмбриональные клетки человека выращивают обычным способом на минимальной специфической среде. Игла с добавлением

1% телячьей сыворотки в стеклянных трубках при температуре ЗЗ С. Восемь групп (по три в ка кдой из таких трубок) обрабатывают испытуемыми растворами соединений в той же среде, содержащей (мг): 200, 50, 12,5, 3 1, 0,8, 0,2, 0,05 и 0,00 испытуемого соединения в

1 мл раствора.

Инкубацию проводят при 33 С, и через

24 час в каждую трубку помещают дозу риновируса, например риновируса типа 2, соответствующую 100-кратной дозе культуры, вызывающей 50% инфекции.

После дополнительной инкубации в течение

2 дней при 33 С каждую трубку исследуют визуально для определения наличия цитопатического эффекта, вызываемого токсичностью соединения. «Активной дозой» испытуемого соединения называется концентрация соединения, которая защищает 50% клеток от цитопатического эффекта, вызываемого ростом вируса. «Токсичной дозой» называют концентрацию испытуемого соединения, которая обусловливает токсичность соединения у 50% клеток культур, обработанных при такой концентрации соединения.

Комплекс и соединения задерживают рост риновируса типа 2 при концентрации равной или менее 0,25 мг/мл, но в то же время не оказывают заме ного токсического эффекта на клетки ткани культуры при дозах, по крайней мере, в 10 раз больших наименьшей активной дозы.

При применении с целью достижения антивирусного эффекта в присутствии клеток хо5 зяина комплекс или:соединение дают хозяину при концентрации близкой к концентрации вируса — от 0,003 до 0,25 мг/мл. Применяют его через нос или горло при дозах от 0,02 до

0,1 мг 3 — б раз в день. Для взрослых людей

10 это эквивалентно дневной дозе от 2 до 20 мг.

Комплекс или его компоненты используют как фармацевтический препарат в форме таблеток, лепешек, капсул, носовых капель, жидкосгей для впрыскивания в нос или горло, 15 аэрозолей или жидкостей для ингаляции. Их можно приготовлять обычными способами с добавкой обычных индифферентных компонентов.

К предпочтительным композициям для не20 посредственного введения (например, в форме лепешки, которая медленно растворяется во рту,,смачивая его и связанные с ним дыхательные пути раствором активного ингредиента) относятся композиции для ингаляции

25 носа или горла в виде растворов антивирусного комплекса или соединения в фармацевтически допустимой жидкости, которая при ингаляции отлагается в носовых проходах и горле, а также композиции для приема внутрь, 33 например, таблетки, 55

0,01

50,00

1,00

Таблетки или лепешки содержат от 0,05 до

5 мг антивирусного соединения. Для профилактики или лечения вирусной инфекции та35 кие таблетки принимают от 3 до б раз в день.

Состав для впрыскивания в нос или горло содержит от 0,01 до 1 мг антивирусного соединения в 1 мл раствора, и для профилактики или лечения риновирусной инфекции при40 мерно 0,1 мл такого раствора впрыскивают в нос или горло 3 — б раз в день.

Композиции могут содержать и другие известные фармацевтически полезные соединения, например, вещества, уменьшающие застой в носу, жаропонижающие средства и антисептики.

Комплекс, соединения или композиции можно применять профилактически всем людям или тем, которые соприкасаются с носителя50 ми риновирусной инфекции.

Пример 1. Питательную среду готовят из следующих компонентов: (вес. ч):

Нитрат натрия 2,00

Первичный кислый фосфат калия 1,00

Семиводный сульфат магния 0,50

Хлорид калия 0,50

Семиводный сульфат железа

Декстроза («церелоза»)

Дрожжевой экстракт (оксоид) 1,00

Концентрат второстепенпых

65 элементов

55291)6

t дуктом, фракция 5 содержит сиродесмины Л, В и С совместно с нежелательным продуктом.

Фракция 6 содержит сиродесмин В совместно с основным продуктом.

5 Фракции 4 —.6 дополнительно разделяют методом хроматографии в тонком слое на силикагеле С. F. Для проявления используют следующие смеси и растворители: 1-ый растворитель — этилацетат н толуол (2: 1), 10 2-ой растворитель — муравьиная кислота, метанол и хлороформ (1: 4: 95). Разделенные продукты выделяют Ilpu элюнровании сооТветствующих полос сх.есшо этилацетата и метанола (97: 3).

15 П р и м ер 3. К питательной реде, приготовленчой как описано в примере 1, добавляют гидроокись калия в виде 10 н. раствора до рН 5,6 и автоклавируют при давлении

0,7 кг/см 25 мин. Sirodesmium diversum

20 С.М.I. 102519 выращивают при температуре

25 С в конических колбах емкостью 500 мл, содержащих по 150 мл среды, на вращающемся устройстве. Через 4 дня 12 мл бульона используют для инокуляции дополнительного

25 количества колб, содержащих такое же количество той же среды. Через 12 дней р-ста получают культуру. Установив рН 6,0, фильтрат (50 мл) дважды экстрагируют головинным объемом хлороформа, Объединенные

30 экстракты выпаривают и полу тают антивирусный комплекс.

Пример 4, Приготавливают раствор для пульверизации в полость носа из следующих компонентов (мг):

35 Сиродесмин А 6

Тимерозал 2

Метиловый эфир параоксибензойной кислоты 80

Пропиловый эфир параоксибензойной ки слоты 20

Фосфат натрия 500

Диттатриевая соль ЭДТК 5

45 Дистиллированная вода (без пирогенов) 0;15

40 до 100 (мл) 50 Способ получения сиродесминов А, G, I, отл ич а ющи и ся тем, что штамм Sirodesmium diversum С.МЛ. 102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, экстрагируют фильтрат

55 культуральной жидкости органическим растворителем, несмешивающимся с водой, выпаривают экстракт досуха, обрабатывают дву— окисью серы в органическом основании и разделяют комплекс при необходимости на ком60 поненты.

Подписное

Заказ 903. 19 Изд. № 326

Тираж 589

ЦНИИПИ

Типография, пр. Сапунс ва, 2

Концентрат второстепенных элементов приготавливают из следующих компонентов (вес. ч):

Семиводный сульфат железа 1,00

Пятиводный сульфат меди

Семиводный сульфат цинка 1,00

Четырехводный сульфат марганца 0,10

Молибдат калия О, 1-0

Эти компоненты растворяют в дистиллированной воде с добавлением концентрированной соляной кислоты в количестве достаточном для получения прозрачного раствора и разбавляют до 1 л дистиллированной водой.

К питательной среде добавляют 10н. раствор гидроокиси калия до рН 5,8 и автоклавируют при давлении 0,7 кг/см 25 мин.

Sirodesmium diversum С.М.I. 102519 выращивают при температуре 25 С в поверхностной культуре в 90 бутылках Томпсона, каждая из которых содержит 1 л питательной среды. Продукт собирают через 35 дней, и фильтрат культуры (70 л, рН вЂ” 6,5) экстрагируют толуо,-.o. . (2 раза по 14 л). Ооъединенные экстракты высупивают безводным сульфатом ттатрття и выпаривают при 60 С.

Остаток (7,1 r) промывают петролейным эфиром (4 раза по 25 м.л), промывную воду отбрасывают и получают активпрусный комплекс.

Пример 2. Антивирусный комплекс, полученный в примере 1, объединяют и разделяют на 2 равные части. Каждую часть отдельно фракционируют на хром атографических колонках, которые приготавливают следующим образом. Колбу емкостью 2 л, содержащую силикагель (900 г) и воду (100 мл) вращают при комнатной температуре 2 час, затем добавляют смесь диэтилового эфира и этилацетата (3: 2; 115 мл), и колбу вращают еще 3 час. Полученный силикагель упаковывают в найлоновый лист и получают сухую колонку размером 90Х4 см. Через верх колонки добавляют экстракт в минимальном объеме смеси эфира и этилацетата (3:2), и колонку проявляют той же смесью растворителей до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет основания колонки. Каждую колонку разрезают на шесть равных секций, объединяют равноценные секции двух колонок и элюируют смесью этилацетата и метанола (97: 3) 3 раза по 500 мл.

При выпаривании растворителей получают

6 фракций: 1-ая фракция наименее полярна, а 6-ая — наиболее полярна. Фракции 1 — 3 отбрасывают, фракция 4 содержит сиродесмины А и С совместно с менее полярным проФормула изобретения