Способ получения алкогольдегидрогеназы

Способ получения алкогольдегидрогеназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

и 553283

ОПИСАНИЕ

И ЗО БР ЕТЕ НИ Я

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 19.12.75 (21) 2300688/13 (51) М. Кл. - С 12D 13/1О с присоединением заявки Ме

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений

H открытий (23) Приоритет

Опубликовано 05.04.77. Бюллетень М 13

Дата опубликования описания 26.04.77 (53) i I,K 577 15 663 1 (088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявптсль

3. А. Виестуре, P. Я. Эзис, А. Ф. Лидере и А. М. Ирген

Латвийский филиал Всесоюзного ордена Трудового Красного

Знамени научно-исследовательского института химических реактивов и особо, чистых химических веществ «ИРЕА» (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКОГОЛЬДFf ÈÄÐÎf EHA3bl

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения рермента — алкогольдегидрогеназы, применяемого в молекулярной биологии и медицине для лечения нервных заболеваний, например алкоголизма.

Известен способ получения алкогольдегидрОГLH33hl I13 Оиомассы дрожжей, Вкл!Очающий плазмолиз дрожжей толуолом, осажденис фермента сульфатом аммония и его кристаллизацию.

Активность алкогольдегидрогеназы после первой перекр исталлизацпи 62,40 ед/мг белка (1).

Активность алкогольдегидрогеназы зависит от качества биомассы дрожжей.

Недостатком известного способа является низкий выход, т. е. низкая активность алкогольдегидрогеназы в первоначальном экстракте биомассы дрожжей, так как обработка биомассы перед выделением для повышения активности алкогольдегпдрогеназы не проводится.

С целью повышения выхода фермента по предлагаемому способу перед плазмолизом дрожжей толуолом дрожжи активируют путем культивирования их на питательной среде, содержащей фосфат калия в течение 1—

6 ч, а затем в питательную среду вводят этанол, витамины группы В, соль цинка и осуществляют культивирование в течение 3 — 6 ч.

Согласно описываемому способу проведением I<) JlbTIIBIIpOBBHIIH биомассы gpo>Ii>I É активностью 0,11 — 0,30 ед/мг белка получают биомассу дрожжей с активностью 0,86—

1,80 ед/мг белка.

Выход алкогольдегидроген азы повышается благодаря дополнительному культивированию исходной биомассы дрожжей.

Культивирование исходной биомассы дрож10 жей проводят в две стадии. На первой стадии введением фосфата калия происходит активация ферментных систем клетки, в том числе ферментов цикла гликолпза. Это достигается путем частичного и обратимого блокиро15 вания окислительных >келезоферментов дро>кжей, в результате чего дыхание клетки частично тормозится и поэтому активируется анаэробная фаза дыхания. На второй стадии добавлением этанола в качестве пндуктора

20 активности à moroльдегидрогеназы вместе с биологически активными веществами в ферментационной среде осуществляется следующая реакция:

1 С 30 С эта пол >- а цетал ьдегид фермент алкогольдегидрогеназа; аэробные условия; перемешиванис.

Таким образом по предлагаемому способу

30 проводят к льтивирование исходного дпожИ3283

Формула изобретения

1970, Составитель T. Серебренникова

Редактор Л, Гончарова Техред Н. Сметанина Корректор О, Тюрина

Заказ 764/!5 Изд. М 493 Тираж 589 Подписпосс

ЦНИИПИ Государств llllol 0 комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,,Ж-35, Рауьиская паб., д. 4/5

Типография, пр. Сап иова, 2 жевого сырья. Биомассу дрожжей (500 г прессованных дрожжей на 1 л среды) суспендируют в растворе фосфата калия (2,7%

КН РО4) и при непрерывном перемешивании и аэрации культивируют 2 — 6 ч. Температура культивирования 25 — 35 С, рН среды 4,5 — 5,5.

Затем к ферментационной среде добавляют этанол, витамины группы В (В„В2, Вв — биотин) или их источники и соли цинка. Процесс культивирования продолжают еще 3 — 6 ч.

Лктивность алкогольдегидрогеназы в биомассе дрожжей 1,8 ед/мг белка. Дрожжи плазмолизируют толуолом, фермент осаждают сульфатом аммония с последующей его кристаллизацией.

Пример 1. В качестве исходного сырья используют биомассу спиртовых дрожжей

Saccharomyces cerevisiae. 1500 г прессованных дрожжей с активностью алкогольдегидрогеназы 0,3 ед/мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10,0 л. В первой стадии культивирования применяют питательную среду, состоящую из 81,0 г

КН РО4 и 1,5 л воды. Температура культивирования 30 С. В реактор через распределитель подают стерильный воздух (3 л/мин).

Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.

После 3 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы дрожжей и в реактор добавляют 150,0 мл этанола, 15,0 г экстракта дрожжей и 4,5 мг ZnC1,.6Н О. После этого процесс культивирования дрожжей при данном режиме продол>кают 6 ч.

Полученную биомассу дрожжей отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентрация алкогольдегидрогеназы в биомассе 1,8 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность алкогольдегидрогеназы повышается с 0,3 до 1,8 ед/мг белка.

Дрожжи плазмолизируют толуолом, экстракт фракционируют сульфатом аммония с последующей кристаллизацией фермента. Получают ферментативную активность алкогольдегидрогеназы 65,3 ед/мг белка.

Пример 2. В качестве исходного сырья используют биомассу хлебопекарных дрожжей Saccharomyces сегечЫае. 1500 г прессо5

30 ванных дрожжей с активностью алкогольдегидрогеназы 0,11 ед/мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10 л.

В первой стадии культивирования применяют питательную среду, состоящую из 81,0 г

КН Р04 и 1,5 л воды. Температура культивирования 30 С. В реактор через распределитель подают стерильный воздух (3 л/мин).

Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.

После 3 ч начинается вторая стадия культивирования биомассы дрожжей и в реактор добавляют 180,0 мл этанола, 15,0 мг витамина BI, 15,0 мг витамина В2, 15,0 мг витамина

Вв, 0,3 мг биотина и 4,5 мг ZnCIq 6Н>О.

После этого процесс культивирования дрожжей продолжают 6 ч.

Полученную биомассу дрожжей отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентрация алкогольдегидрогеназы в биомассе 0,86 ед/мг белка.

В сравнении с исходным сырьем активность алкогольдегидрогеназы повышается с

0,11 до 0,86 ед/мг белка. Ллкогольдегпдрогеназу из биомассы дрожжей выделяют, как в примере 1.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение активности алкогольдегидрогеназы в биомассе дрожжей до 0,86 — 1,80 ед/мг белка

Способ получения алкогольдегпдрогеназы из биомассы дрожжей, включающий плазмолиз дрожжей толуолом, осаждение фермента сульфатом аммония и его кристаллизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, перед плазмолизом дрожжей толуолом дрожжи активируют путем культивирования их на питательной среде, содержащей фосфат калия в течение 1—

6 ч, а затем в питательную среду вводят этанол, витамины группы В, соль цинка и осуществляют культивирование в течение

3 — 6 ч.

Источник информации, принятый во вни. мание при экспертизе

1. Журнал «Biochemical Journal», 118, 375.