Способ подготовки сыворотки для диагностики риккетсиозов

Способ подготовки сыворотки для диагностики риккетсиозов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е (11) 553289

И3ОБРЕТЕ Н ИЯ

Союз Советских

Социалистически»

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 30.07.73 (21) 1954562/13 с присоединением заявки (23) Приоритет(51) М. Кл,е

С12К 5/00

Государствеииый комитет

Совета Министров СССР во делам изобретеиий и открытий.(43) Опубликовано 05.04. 77Бюллетень № 13 (53) УДК615.373, (088.8) (46) Дата опубликования описания 16.07.77

П. С. Барбан и В. Я. Мирский (72) Лвторы изобретения

Пермский ордена, Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт вакцин и сывороток, 71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СЫВОРОТКИ ДЛЯ

ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗОВ

Изобретение относится к области серологических методов исследования, исполь" зуемых для лабораторной диагностики ин фекционных заболеваний человека риккетсиОэной этиологии В частности Волынской ли» 5 хорадки, в основу которых положен принцип использования антигенных диагностических препаратов, с целью исследования сывороток на наличие в них иммунных тел.

Известный способ подготовки сыворотки lp для диагностики риккетсиоэов заключается в том, что исследуемую сыворотку подвергают взаимодействию с антигеном с пос» ледующим окрашиванием образовавшегося комплекса антиген + антитело смесью !5 флюорохромов (акридина оранжевого, тиОфлавина и ауромина) (1).

Недостатком известного способа является то, что любой неспецифический конгломерат или тело„геометрически на него поко- 2р жее, будет имитировать специфический агт югттттат, искажать результаты наблюдений и сии>кать достоверность диагностики.

Кромс. того, возиикает сильное неспенифи .«ское свечение фона исследуемого 25 препарата, что еще в большей степени затрудняет интерпретацию результатов наблюдения и, следовательно, уменьшает дос» товерность диагнос ики, С целью повышения достоверности диагностики заболеваний рнккетсиоэной гилогии, предложено при осутцествлении т акции микроагглютинации испольэова. - и качестве тест-антигена люминесцируюший корпускулярный диагностикум Квинтана, Предложенный способ позволяет с большой достоверностью выявить специфические антитела в иммунных сыворотках.

Используемый в предлагаемом способе сухой люминесцируюший диагностикум

Квинтана представляет собой выращенные на питательной среде КИМ ипактивирова» ные, очищенные, меченные изотиоцианатом флюоресцеина и лиофильно высушенные риккетсии Квинтана.

Технология приготовления сухого люминесцирующего диагностикума сводтттся к следуюшелту. Инактивированную, очищенную взвесь риккетсий Квинтана, приготовленную согласно "Инструкции по изготов553289 лению, контролю иприменению волынскогориккетсиальн о го антигена для реакции связывания

)> комплемента от 1964 года, подвергают коньюгированию с флюорохромом-изотиацианатом рлюоресцеина. Коньюгацию ж) одят и смеси 0,5М карбонатно-бикарбонатного буферного раствора с 0,9%ным раствором хлористого натрия при постоянном перемешивании в течение 18 час при температуре 4 С.

После коньюгации взвесь меченых риккетсий Т0 отмывают трехкратно в 0,5%ном растворе (забуференном) хлористого натрия с последующим центр ифугир ова кием при 1 0 000 об/м ин в течение 30 мин. После третьего цен;)ифугирования полученный Осадок ме 5 ч;.. .ых риккетсий взвешивают в дистиллированной воде и стандартизуют методом прямого счета меченых рихкетсий в люминеоцентном микроскопе. Концентрация меченых риккетсий доводится до 1,5 млрд в 1 мл. р0

К полученной стандартизованной взвеси меченых риккетсий добавляют наполнитель следуюшего состава: сахароза 1,5 А, нормальHGB инактпвированная сыворотка кролика О, 10 о.

Приготовленный диагностикум разливают в ам- 15 пупы по 0,5 мп и подвергают лиофильному высушиванию по режиму комплемента, применяемому в производстве биопрепаратов.

IIepea постановкой реакции микроагглютинации диагностикум разводят дистиллиро- 30 ванной водой в объеме, указанном на этикетке ал1нупы. Готовят последовательные двухкратные разведения исследуемой сыворотки на физиологическом растворе (ОE I 7,0-7,2); Ica рифленое предметное . стекло, разделенное на 8-10 квадратов, с помошью туберкупннового шприца с тонкой иглой наносят на каждый квадрат стекла по капле каждого разведения сыворотки, начиная с большего. Е!ругил4 туберкулиновым 40 шприцем с гонкой иглой к капле каждого разведения исследуемой сыворотки добавляют но капле люмпнесцируюшего днагности- кума Квшпана. Параллельно на этом же стекле ставят контроли; 1-й — на отсутсч 45 вио спонтанной агглютинации - к капле физиологического раствора добавляют каплю диагностикума; 2-й — на специфичностьк капле иммунной гетерологичной сыворотки Провачека, взятой в том же начальном раз- 50 ведении, что и исследуемая сыворотка, добавляют каплю люминесцирующего диагностикума

Квинтана. Взаимодействие антигена с антитеlIDM происходит во влажной камере, помещенной на 2 час в термостат при температуре 37оС. 55

После этто стекла высушивают, и они готовы для исследования.

Учет результатов реакции проводят в поле зрения люминесцентного микроскопа

М (объектив 90, окуляр 7", светофильтры:

СЗС-24-4, УФС6-5, БС-8-2) или обычно го микроскопа, снабженного люминеспентйым: осветителем ОК-17.

При просмотре препаратов в поле зрения микроскопа выявляются ярко- зеленые тела риккетсий на общем фоне черного цвета, При положительных результатах реакции риккетсии сформированы B агглютинаты различной величины. При этом размеры оора-. зуюшихся агглютинатов, как правило, обратно пропорциональны разведению исследуемой сыворотки.

Оценка результатов реакции Ilpoooäèòñÿ по четырехкрестной системе нри условии просмотра не менее 8-10 попей зрения препарата: "++++" - все нросл1отре))ные поля зрения заполнены, преимушестиенно, крупными агглютинатами и незначительным числом отдельно расположенных рикке а=ий;

+ + + " - все просмотренные ноля зрения заполнены, главным образом, агглютинатами средней величины и умеренным количеством отдельно расположенных риккетсий; "+ + — все просмотренные поля зрения заполнены в основном мелкими агглютинатами и значитегьным числом отдельно расположенных риккетсий; " + " — все просмотренные поля зрения заполнены отдельно расположенными рнккетсиял1и и единичными мелкими агглютинатами, При отрицательных результатах реакции риккетсии во всех просмотренных полях зрения располагаются отдельно.

Чтение и учет реакции начинается с контролей, Во всех контролях должны быть по- лучены отрицательные результаты, Реакция считается положительной при интенсивности л1икроа)тп)отинации l) разведениях исследуемой сыворотки не менее, чем на 3+. При аггпютинации на + суждение о специфической природе cllòïlo Ill)).lò;I следует считать сомнительным, E итр исследуемой сыворотки соотиетс)вует максимальному ее разведению, I) котором )III» тенсивность агглю гинац ьч пк)ми)юсцируюIIIего диагностикума оценивае)ся ие ниже, чем на 3+. При этом необходимо учитывать, что в соответствии с условиями постановки иммунофлуоресцеитнои реакции микр агглютинации разведения сыворотки в опыте и контроле при добавлении диагностикума увеличиваются в 2 раза, Пример осушествления способа поп) отонки сыворотки к диагностике волынской лихорадки.

Материалы и методы, 1. Сухой люминесцируюший диа) иостикум Квинтана для иммунофлю )ресн"нтной реакции м икр оагглютинации -:эксне()имен

553289

1:320 1:160 1:160 1:320

ИФРМ А

Ф ормула изобретения

При проверке специфичности иммунофлюс ресцентной реакции микроагглютинации при изучении нормальной сыворотки кролика, а также имйунных сывороток к другим видам

35 риккетсий (Провачека, Сибирикус), положительных результатов не получено. Одновременно следует отметить, что ИФРМА с люминесцируюшим диагностикумом Квинтана в методическом отноШении очень простая, 40 а результаты реакции получаются демонстративными и легко поддаются учету.

Составитель Б. Суханов

Редактор В. Смиригииа Текред О. Jlyroaaa Коррекгор Н, Зололоеокаи

Заказ 208/40 Тираж 541 Подписное

Ш1ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, и. 3/5

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 тальники серия M 2> приготовленный в лаборатории энлемических риккетозов Пермского НИИ вакцин и сывороток, запаян в ампулы ББЖ, содержимое каждой ампулы регидратируется в 0,5 мл дистиллированной воды, 2, Иммунные сыворотки к риккетсиям

Квинтана сер. 2,3,7,8, 3. Иммунная сыворотка к риккетсиям

Провачека сер. j. 04, При изучении иммунных сывороток к риккетеиям Квинтана при помоши иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации удается выявить специфические антитела в титрах 1:80-1:320.

4. Иммунная сыворотка к риккетсиям

Сибирикус сер. 8, 5. Нормальная сыворотка кролика.

6, Иммунофлюоресцентная реакция ми» кроагглютинации (ИФРМА), Результаты испытания.

Результаты изучения в ИФРМА иммунных сывороток к риккетсиям Квинтана, Провачека и Сибирикус, а также нормальной сыворотки кролика.

Способ подготовки сыворотки для диагностики риккетсиозов, включаюший взаимодействие сыворотки с антигеном, о т л и— чаюшийс я тем, что, с цельюповышения достоверности диагностики волынской лихорадки, в качестве антигена используют люминесцируюший корпускулярный диагностикум Квинтана, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. В. Г. Затуловский и др. Применение люминесцентно-с:еролсгических методов лабораторной диагностики риккетсиозов . Сб, "Вопросы иммунологии", Киев, 1965 r., стр. 184-188.