Способ получения -триптофана и его производных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ.„„„„,а

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 02.02.73 {21) 1879776/13 (5l) М. 1 л, С 12 D 13/06 (23) Приоритет — (32) 03.02.72 (31) 1231/1972 (33) Швеция (43) Опубликовано 05.04.77. Бюллетень №.13 (53) УДК 663.1 (088.8) (45) Дата опубликования описания 29.11.77

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Ларс-Эрик Паульссои, Оке Виллард Ольссон и Ларс Ингвар Вивергер (Швеция) Иностранная фирма

"Актиеболагет Бофорс" (Швеция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L — ТРИПТОФАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

С вЂ” СНр-Сн — иН

I.(н POOH

Сн (.H

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению 1 - триптофана и его производных методом непрерывной ферме нтации.

Известен способ получения 1 - триптофана и его производных общей формулы

Н где Й вЂ” водород, гидрок сил, галоген, алкил или ьпкоксил„путем выращивания дрожжей рода

Candida в азробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, в частности соли железа, и предшественники триптофана или его производных, в качестве которых используют индол или его производные общей формулы где R имеет укаэанные выше значения, с последующим выделением готового продукта. Однако по известному способу ферментацию триптофана ведут в прерывном режиме, С целью возможности получения триптофана и

его производных в непрерывном потоке предложено в качестве продуцента из рода Candida использовать вид humicola, количество железа (Fe ) в

2+ процессе культивирования поддерживать в диапазоне 0,1 - 0,2мг, %, а азрацию осуществлять при подаче воздуха в пределах 10-12 л/час на 1 л среды.

Рекомендовано использовать Candida hurnico la штамм j 1А CH X11 (CBS6434). Кроме того в питательную среду добавлчют тиамин, ниацин и глицин.

Штамм Candida humicola был получен после отбора и проверки более 600 культур из различных образцов почв. Штамм идентифицирован, описан и зарегистрирован в Центральном бюро дрожжевых

gg культур и микроорганизмов (central Bureau voor

Schimmel —. Cultures) под номером j 1А СН ХП (CBS 6434) .

По предлагаемому способу ферментацию триптофана или его производных с использованием штамма Candida humicola осуществляют в аэроб553938 з ных условиях Ври непрерывном добавлении пита- тельного субстрата с отдельным непрерывным внесением в систему соответствующего индольного производного.

Применяемый штамм характеризуется высокой интенсивностью превращения индола в L - триптофан. Штамм можно выращивать на среде определенного состава, причем для его роста, помимо углево-, дов и тиамина (витамин B»), не требуются какиелибо другие органические вещества.

Используемый штамм Candida humicota имеет частично действующий путь метаболизма триптофа.на, включающий его разложение, каталиэуемое триптофан- пирролазой.

Однако, изменяя условия культивирования и состав питательной среды, можно подавлять процесс разложения триптофана. Для того, чтобы стимулировать образование мутантов, неспособных разлагать триптофан, в среду можно добавлять ниацин в концентрации 0,05 - 0,5 г/л.

Подаваемый в необходимом количестве в культуральную среду индол проникает через клеточную стенку и превращается;внутриклеточныьгл f ферментами системами в триптофан, который в значительной части снова выводится из клетки в культуральную жидкость. Сравнительно низкие концентрации свободного индола могут понижать скорость роста клеток.

Однако превращение индола в триптофан происходит очень быстро и добавление, например, 0,5 % (вес/объем) ицпола по отношению к весу субстрата в ферментационную систему будет приводить лишь к незначительному содержанию свободного индола в ферментационной среде.

Очень важно в этой связи определять содержание индола в ферментере в расчете на субстрат, содержащий клетки микроорганизма, поскольку очень большое количество свободного индола находится внутри клеток.

Особенностью предлагаемого способа, которая, по-видимому, оказывает наибольшее влияние на скорость превращения индола в триптофан и на деградацию триптофана через кинуренин, является наличие в культуральной жидкости определенной концентрации биологически усвояемого железа, например, в виде двухвалентного лимоннокислого железа.

Концентрация железа (Fe +) в культуральной жидко ти должна быть ниже такого количества железа, которое вызывает разложение триптофана, но выше количества, при котором рост культуры нарушается и непрерывное культивирование становится, таким образом, невозможным.

На скорость разложения триптофана влияет количество растворенного кислорода в ферментационной среде, поскольку триптофан — пирролаза является ферментом, содержащим гемовую группу, и разложение триптофана является, таким образом, окислительным процессом.

При низком уровне. аэрации в культуральной

60 жцщсости можно поддерживать относительно высокую концентрацию Fe, при высоком уровне аэрации содержание железа должно быть низким. Эти наблюдения справедливы для штамма Candida

hum i cola дикого типа.

Однако в процессе непрерывной ферментации в течение длительного времени могут возникать мутанты, у которых отсутствует разложение триптофана. Этому способствуют условия культивирования: состав среды (особенно наличие ниацина в среде), непрерывная подача индола и т.д. В этом случае концентрация железа в среде не будет иметь решающего значения для разложения триптофана и ее можно поддерживать на значительно более высоком уровне. Благодаря этому в качестве источника углерода можно применять мелассы, имеющие обычно высокое содержание железа.

Для того, чтобы в среде не создавалось высокой концентрации остаточного индола, подавляющей рост штамма, необходимо периодически проводить анализ.

Уровень насыщения кислородом ферментационной среды значительно возрастает при повышении в среде концентрации остаточного индола в результате того, что в этих условиях культура перестраивается с аэробного на анаэробный тип метаболизма.

Этот параметр можно использовать для контролирования скорости поступления лимоннокислого железа или степени аэрации.

Количество клеток также служит критерием, по которому можно судить о протекании процесса, однако изменения в этом случае происходят настолько медленно, что их практически невозможно использовать для контроля за процессом фермента ции.

Остаточный индол определяют методом газовой хроматографии в пробах, содержащих клетки (определение индола в ферментационной жидкости, освобожденной от клеток, не дает правильных результатов, так как индол быстро поглощается клетками) .

Слишком высокое содержание остаточного индола можно использовать как сигнал для уменьшения скорости подачи индола в систему и/или увеличения поступления железа, и/или для увеличения аэрации.

Выход триптофана контролируют путем непрерывного анализа на колонке с сефадексом с применением "Увикорда" и последующим анализом триптофановых фракций в ультрафиолете. Этим методом можно определить некоторые метаболиты триптофана и, главным образом, кинурениновую кислоту.

Способность используемого штамма синтезировать триптофан не лимитируется ингибированием по типу обратной связи, Культура Candida humicola выдерживает до 15 г/л триптофана в среде без какого-либо изменения скорости его синтеза.

Фактором, ограничивающим выход триптофана по описанному способу, является способность микроорганизма синтезировать серии. Потребление ин553938

Ниацин, г

0,5

Тиамин, Mr

Растор К, мл

Раствор А, мл

100

Раствор Â, мл

200 зо Раствор В,, мл

200

Раствор С, мл

200

Дрожжевой экстракт, r

Раствор А, мл

Раствор В, мл

200

200

Раствор С, мл

200

До 10

5 дола штаммом резко возрастает при добавлении в ферментационную среду сврина.

Поскольку серии дорогое вещество, было изучено влияние на выход триптофана добавок глицина, Глицин оказывает такое же влияние на выход триптофана, что и серии, яо этот эффект проявляется не сразу, а через несколько часов после добавления глицина в среду.

При внесении глицина в количестве 1-10 г/л скорость введения индола в ферментациониую среду может быть значительно увеличена.

Для выделения и очистки полученного трипто-. фана из культуральной жидкости, освобожденной от клеток, применяют метод ионного обмена. После пропускания культуральной жидкости через колонку со смолой смолу промывают дистиллированной водой. Элюирование триптофана осуществляют раствором, содержащим 50% этанола и 50% 1 М раствора аммиака, с использованием противоточного метода.

Полученный раствор триптофана нейтрализуют соляной кислотой, и получают кристаллический триптофан, выход которого около 95%..Продукт имеет 100 %- ную биологическую активность согласно стандартному тесту с S. fecaiis.

Предложенный способ иллюстрируется примерами, которые не ограничивают его, Пример 1. Низкая скорость дабавления индола и высокое содержание железа. ферменте р. Аппарат типа Химан {Chemap J F

0014) с механическим пеногасителем, число оборотов 2 000об/мин, скорость добавления субстрата

200 мл/час, объем 4,8 л, скорость разведения

4,1 %, Температура 26 С.

Субстрат.

Индол, г

n — Аминобензойная кислота (ПАБК), г

Глюкоза (стерилизована отдельно), кг

Дистиллированная вода, л рН 5,5

Раствор А: 3% CaCI2 ° 2Н20.

Раствор В: 10% КН2Р04.

Раствор С: 5% MgSO4 ° 2Н20, 0,125% железо лимоннокислое, 0,02% ZnS04 ° 7НэО и 10% NaCI, Аэрация 80 л/час л среды.

Ферментер засевают 50 мл односуточной культуры Candida humicola, выращенной на качалке. рН в процессе культивирования поддерживают около

6,5 аммиаком, Культуру выращивают в течение 24ч, после чего добавляют субстрат и индол. Скорость подачи индола устанавливают на уровне 0,14% (sec/î6ìM) .по отношению к скорости подачи субстрата.

При содержании. железа лимоннокислого

24 мг/л скорость потребления индола высокая, при. чем не наблюдается остаточного индола. Однако в зтих условиях триптофан практически не получают, вероятно, в результате того, что образовавшийся

I0 тринтофан сразу же разлагается до кинурениновой кислоты и других метаболитов.

Пример 2. Низкое содержание индола н низкое содержание железа.

Условия те же, что в примере 1. Отличие в составе питательной среды:

NH4CI, r 50

20 Железо лимоннокислое, мг

Сахароза, кг

35 Дистиллированная вода, л До 10

Раствор А: 0,75% СаС1, 2НэО

Раствор Â . 8% КНэР04, 2,56% Кэ НР04

Раствор В2 . 10% КН Р04

Раствор С: 7,88 % MgSO4 7Н20, 0,11 %

40 MnSO4 Нэ0,0,02% ZnS04 ° 7НэОи 10% йаС!.

Раствор К: 0,068 г аммония молибденовокислого, 0,34г CuSO4 Засев, рН и культивирование те же, что и в примере 1. Скорость добавления индола

45 0,265% по отношению к скорости введения субст- . рата. Выход триптофана в процессе ферментации

З,б г/л сутки (эффектнвность, превращения индола в триптофан 78%). Разложения триптофана не наблюдается.

50 Пример 3. Высокое содержание индола и периодическое добавление железа лимоннокцслого.

Условия ферментации те же, что и в примере 1.

Питательная среда, как в примере 2. Засев, рН и у культивирование такие же, как в примере 1. Скорость добавления индола в ферментационную среду составляет 0,53% (вес/объем) от скорости введения субстрата. Выход триптофана в процессе ферментации в среднем составляет 6,8 г/л сутки (эффективность процесса 74%). Железо лнмоннокис553938

Составитель Л. Минееева

TexPeJL Н. Андрейчук

Редактор Л. Ушакова

Корректор П. Макаревич

Заказ 1017/53

Тираж 541 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д 4/5

Филиал ППП "Патент *, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 лое вносят в ферментационную среду при каждом увеличении содержаний остаточного индола. ,П р и и е р 4. Непрерывное добавление железа лимоннокислого.

Условия проведения процесса, состав питательной среды, засев, рН, культивирование, как в примере 1, но аэрации составляет 10л/час на 1л среды.

Железо лимоннокислое добавляют с такой скоростью, чтобы его концентрация в среде примерно составляла 2 мг/л. Скорость введения индола равна

0,4% от скорости внесения субстрата. Выход трип тофана 5,9 г/л сутки (эффективность превращения индола в триптофан 80,5%). После того как режим ферментации стабилизирован, разложение триптофана не наблюдается.

Пример 5. Влияние глицина.

Условия ферментации, засев, рН, культивирование, как в примере 1. Аэрация 10 л/час на 1 л среды, Питательная среда как в примере 1, за исключением того, что в нее добавляют 2 мг/л Fe и 1,5 г/л глицина. Скорость добавления индола составляет

0,8% от скорости внесения субстрата Выход трип-i тофана 10,4 г/л сутки (эффективность 75%) . В течение всего времени ферментации наблюдается очень низкий уровень остаточного индола. Разложение риптофана также очень незначительное, так как за весь опыт образуется всего лишь 0,2 г кинурениновой кислоты.

Пример 6. Условия ферментации те же, что и, в примере 1. Питательная среда, как в примере 1, за исключением того, что содержание железа (Fe++)

0,2мг.%. Засев, рН и культивирование такие же, как в примере 1. Аэрация 12л/час на 1л среды.

Добавляют 5 - ОН. - индол в количестве 0,4% от количества вводимой питателыюй среды, Количество 1 - 5 - ОН - триптофана за 24ч культивирования в среднем 4,3 г/л (выход 64%).

Пример 7. Условия ферментации, засев, рН и культивирование, как в примере 1, среда, как в примере 1, но содержание железа (Fe +) 0,22 мг.%.

Аэрация 10л/час на 1л среды, Добавляют 0,8%

6-метнлиндопа от количества субстрата.

Через 24 ч получают 2,4 г/л L - 6 - метилтриптофана (выход 51%).

Пример 8. Условия ферментации, засев, рН и культивирование, как в примере 1.

Среда, как в примере 1, но содержание железа

0,2 мг. %. В среду добавляют 0,28% 5-метоксииндола. Через 24ч получают.2,55г/л 1 - 5 - метокситриптофана (выход 57%) .

Пример 9. Условия ферментации, засев, рН и культивирование, как в примере 1. Среда, как в

5 примере1, но концентрация железа 0,18мг.%. В питательную среду добавляют 0,36% 4 - ОНиндола. Через 24ч получают 4,2г/л L - 4 - ОНтриптофанв (выход 70%).

Формула изобретения

1, Способ получения 1 - триптофана и его производных общей формулы

C— - eH г-еН -юн, 1 1 я-Сн ооон

Н

" — водород, гидроксил, галоген, ал путем выращивания дрожжей ро

Candida в азробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, в частности соли железа, и прещпественники триптофана или его производных, в качестве которых используют индол или его

25 производные общей формулы

Н где R имеет указанные выше значения, с последую щим выделением готового продукта, о тли чающий ся тем, что, с целью возможности получе35 ния триптофана и его производных в непрерывном потоке, в качестве продуцента из рода Candida используют вид humi cola, количество железа (Fез ) в пРоцессе кУльтивиРованиЯ поддеРживают в диапазоне 0,1-0,2 мг.%, а аэрацию осуществляют при подаче воздуха в пределах 10-82л/час на 1л среды.

2. Способпоп. 1, о тлича ющий ся тем, что используют Candida humicola штамм J1A СН XI l (CBS 6434).

3. Способ по пп. 1и 2, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют тиамин.

4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют ниацин.

5. Способ по пп. 1-4, отличающий ся тем, что в питательную среду добавляют глицин,