Штамм ибфм в-292

Штамм ибфм в-292

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С A Н И E 556176

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Реслублнк (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 29.01.75 (21) 2102760/13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 30.04.77. Бюллетень № 16

Дата опубликования описания 29.06.77 (51) М. Кл."- С 12К 1/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР

Ilo делам иХооретений и открытии (53) УДК 663.1(088.8) (72) Авторы изобретения

Т. И. Чистякова и В. К. Ерошин

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (71) Заявитель (54) ШТАММ MYCOBACTERIVM MUCOSUM ИБФМ В-292

Изобретение относится к технической микробиологии и касается штамма Mycobacterium

mucosum ИБФМ В-292 — продуцента биомассы, который может найти применение для очистки от нефтепродуктов. Этот штамм выделен из приборной смазки ОКБ-122-7.. Штамм хранится в коллекции ИБФМ АН С(."СР. Его коллекционный номер ИБФМ В-292.

Известны штамиы Mycobacterium, растущие на различных углеводородах.

Штаммы Mycobact. cuneatum u Mycobact.

petroleophilum потребляют .в процессе роста газообразные углеводороды С вЂ” Со, н-парафины С1 — Сд, керосин, легкое и тяжелое масло.

Выход биомассы 30 — 70% по весу от потребленного углеводорода, 17% от потребленного масла. Спектр потребляемых описанными штаммами Mycobacterium углеводородов и других нефтепродуктов недостаточно широк.

Предлагаемый штамм Mycobact. mucosum

ИБФМ В-292 использует в процессе роста не только более широкий спектр н-парафинов, но и непредельные, ароматические углеводороды, а также различные нефтепродукты, например масла, смазки и т. д.

Выход биомассы при выращивании на смеси н-парафинов составляет 70 — 80% г/л по сухому весу. При использовании масла в качестве источника углерода штамм потребляет

53% внесенного в среду масла. Штамм также способен расти на морской воде с нефтепродуктами.

В лиофилизирован ном состоянии штамм сохраняет жизнеспособность не менее полутора лет, и порошок лиофилизированных клеток может быть использован для распыления над залитыми нефтепродуктами районами, а также для очистки баков, хранилищ, резервуаров и т. д.

10 Предлагаемый штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические и культуральные признаки. Неподвижные, неспорообразующие, грамположительные палочки. Через 12 час выра15 щивания в мясо-пептонном бульоне при 29 С клетки крупные (длиной до 20 мкм), искривленные, неправильно очерченной формы.

Обычно длина клегок 8 — 10 мкм, Колонии на мясо-пептонном агаре круглые, 20 блестящие, слизистые, клейстерообразной структуры, розовато-палевые.

Отношение к углеводородам. Использует широкий спектр индивидуальных углеводородов и различных нефтепродуктов.

25 Отношение к сахарам. Лссимилпрует Dглюкозу, D-маннозу, D-галактозу, L-арабинозу, D-маннит, D-сорбит, сахарозу, мальтозу, лактозу, глицерин, рафинозу.

Отношение к органическим кислотам. Асси30 милирует ацетат, пропионат, бутират, лактат, 556176

10

20 сукцинат, цитрат, бензоат, фумарат, салицилат, никотинат.

Отношение к источникам азота. Ассимилирует аммонийный и нитратный азот.

Желатину не разжижает.

Крахмал не гидролизует.

Кислотообразование при росте на средах с углеводами очень слабое.

Растет в диапазоне температур от 4 до

35 С. Оптимальная температура ipocra 29 С.

Максимальная температура роста 35 С.

Диапазон рН среды 4,0 — 8,0. Оптимальный рН среды 6,9.

Способен расти в морской .воде с нефтепродуктами.

Сапрофит.

Пр имер 1. Штамм Mycobacterium mucosum В-292 выращивают в ферментере, представляющем собой цилиндрический аппарат со сферическим дном и крышкой. Рабочий объем ферментера 75 л, высота 80 см, диаметр

40 см. Аппарат снабжен рубашкой для нагревания и охлаждения, двухсекционной лопастной мешалкой, электрообогревом для автоматического поддерживания температуры. Колебание температуры в ферментере 0,5 С.

Регулировку температуры производят автоматически с регистрацией на самописце по контрольному термометру. Воздух подают через барботеры от центральной воздушной линии и очищают двукратным пропусканием через фильтры из специальной антимикробной ткани на гексахлорфеноловой основе, выпускаемой Московским текстильным институтом.

Автономный фильтр перед работой стерилизуют горячим паром с температурой около 140 С в течение 1,5 — 2 ч. Контроль за расходом воздуха осуществляют по показаниям ротаметра

PC-5. В ферментере поддерживают избыточное давление около 0,5 атм, контролируемое при помощи манометра.

Для засева ферментера используют 5 — 6 л инокулята с содержанием клеток 2,5 — 3,0 г/л (по сухому весу). Инокулят получают,в ферментере АК-10 на минеральной среде 8-E следующего состава: (NH4) НР04 1,5 r

КН Р04 0,7 r

MnSO4 7Н О 0,8 г

Na CI 0,5 г

FeCIq 6Н О 16700 мкг

СаС1> 2Н О 660 мкг

ZnSO4 Н,О 180 мкг

CuSO4 5Н О 160 мкг

MnSO4 4Н О 150 мкг

СоС1 6Н О 180 мкг

Вода дистиллированная До 1 л

Среду стерилизуют при 1 атм в течение

1,5 час. Дозу фосфатов,на 1 л среды растворяют в 20 мл дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм и добавляют к остальной части отдельно простерилизованной среды.

Стерильную жидкую смесь парафинов (Crr—

С 4) добавляют в количестве 20 мл/л. Тем25

З0

4 пература плавления парафина 20 C; примесь ароматических веществ 0,5О/о, нормальные углеводороды 90 .

Инокулят выращивают при 28 С, количество воздуха 6 л/мин, скорость мешалки

800 об/мин. Аппарат засевают стерильно через вводное отверстие в ф ерментере. Остатки посевной культуры используют для контрольной проверки на стерильность.

Штамм для получения микробной массы выращивают на минеральной среде 10-Е следующего состава:

КН Р04 3,0 г

MgSO4 7НЯО 2,0 г (NH4) gSO4 1,0 г

Na C1 2,5 г

СаСI, 2Н,О 1300 мкг

ХпЬО» 6Н,О 360 мкг

CuSO4 ° 5Н О 320 мкг

MnSO4. 4Н О 300 к1

CoCI 6Н О 360 мкг

1 еС1з 6Н О 3330 мкг

Вода дистиллированная До 1 л

Стерильный парафин добавляют в количестве 100 мл на 1 л среды.

Штамм выращивают в ферментере на 100 л при следующем режиме: температура 28 С, количество воздуха — один объем на один объем среды в минуту, непрерывно работающая мешалка (600 об/мин), избыточное давление в аппарате 0,5 атм, при,вспенивании среды гашение пены осуществляют добавле.нием касторового масла в количестве 5—

10 мл.

При выращивании штамма значение рН поддерживают автоматически в пределах

6,61-0,05, Содержание биомассы в культуре определяют по расходу аммиака, идущего на построение клеток, а в конце опытов — взвешива:нием образца, высушенного в вакууме и отмытого от углеводородов хлороформом.

При выращивании культуры в течение

40 час биомасса клеток составляет 70 — 80 г/л среды в,расчете на сухой вес. Клетки суспендируют в среде, содержащей 10О/о сахарозы и 1,5 /о желатины..Суспензию клеток разливают,в ампулы и замораживают в автоматическом морозильном столе .с магазином типа

ZZ 150/50, после чего их переносят в чешскую сушильную установку К$-30. Высушивают при 4 С ia течение 48 ч. Ампулы после лиофилизации запаивают под вакуумом.

Титр клеток в запаянных ампулах остается без изменений, по крайней мере, в течение полутора лет.

Пример 2. Штамм Mycobact. mucosum

ИБФМ В-292 выращивают при 28 С на качалке (160 об/мин) в колбах емкостью 750 мл с объемом среды 100 мл+2 об. /О индустриального масла (веретенное-3) на среде 8-E в течение 5 дней.

После выращивания культуры содержимое колб переливают в делительную воронку. При

556176

Составитель С. Андреева

Техред М. Семенов

Редактор Н. Хубларова

Корректор Л. Орлова

Заказ 1121,/10 Изд. № 421 Тираж 560 Подписное

Ц1-1ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

1!3035, Москва, Ж-З5, Раушская иаб., л. 4, 5

Типография, пр. Сапунова, 2 отст-ивании образуется 2 слоя: верхний масло и клетки микроорганизма, нижний водный раствор. Нижний слой удаляют, а масло экстрагируют трижды этанолом и изооктаном в соотношении 2: 3 по объему при интенсивном взбалтывании 5 — 8 мин.

Растворители добавляют раздельно, причем сначала дооавляют этанол, затем изооктан. Разрушение стойкой смеси достигается с помощью данного соотношения растворителей.

Для удаления следов воды к экстракту масла добавляют мелко измельченный хлористый кальций. Смесь подогревают в сушильном шкафу при 70 — 80 С, затем фильтруют через стеклянный пористый фильтр № 3, Далее масло взвешивают и сравнивают его вес с весом масла в контроле.

В результате роста Mycobact. mucosum

ИБФМ В-292 на среде с индустриальным маслом в течение пяти суток потребление масла составляет 53,1 о/о, Формула изобретения

Штам м Mycobacterium mucosum ИБФМ

В-292, применяемый для борьбы с загрязнением нефтепродуктами. Хранится в коллекции

ИБФМ AH СССР.

Морфологические признаки, Неподвижные, неспорообразующие грамположительные палочки. После 12 час выращивания в мясо-пептонном бульоне при 29 С клетки крупные (длина до 20 мкм, искривленные, неправильно очерченной формы).

Обычно длина клеток 8 — 10 мкм.

Колонии на мясо-пептонном агаре круглые, блестящис, слизистые, клейстерообразной структуры, розовато-палевые.

Физиологические признаки.

Отношение к сахарам и спиртам. Ассимилирует D-глюкозу, D-манн азу, D-галактозу, L-арабинозу, D-маннит, сахарозу, мальтозу, лактозу, рафинозу, глицерин.

Отношение к органическим кислотам. Ассимилирует уксусную, пропионовую, масляную, молочную, янтарную, лимонную, бепзойную, фумаровую, салициловую, никотиновую кислоты.

Использует широкий спектр индивидуa;II ных углеводородов и различных нефтепродуктов.

Отношение к источникам азота. Ассимилирует аммонийный и нитратный азот.

5Келатину не разжижает. Крахмал пс гидролизует.

Кислотообразование при росте на средах с углеводами очень слабое.

Растет в диапазоне от 4 до 35 С, Оптимальная температура для роста 29 С.

Рост возможен в диапазоне рН 4 — 8. Оптимальный рН среды 6,9.

30 Сапрофит.

Штамм способен расти в морской воде нефтепродуктами.