Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

» 556732

ОП ИСАЙ ИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 12.11.65 (21) 1037618/13 (23) Приоритет— (32)— (51) М.Кл С 12D 9/00

Гасударственный камитет

Саеета Министрав СССР па делам изабретений. и аткрьпий (33)— (31)— (43) Опубликовано 30.04.77. Бюллетень № 16 (45) Дата опубликования описания 14.11.77 (53) УДК 615.779. .9(088,8) (72) Авторы изобретения И ностр анцы

Дениз Манси, Леон Нине и Жан Преном (Франция) Иноспранная фи рма

«Рон-Пулеик А. О.» (Фракция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится z области медицины, в частности к производству антибиотиков.

Предлагается способ получения нового антибиотика 8.036 R.P., где в .качестве грибапродуцента используют штамм Steptomyces

canadiensis ККР1 3155.

Штамм зарегистриро|ван в Северной областной исследовательской лаборатории в Преории, Иллинойс, США под номером NRRL

3155.

Этот организм выделен из образца грунта, взятого в Канаде в провинции К ввбек гра фства Водрей, в Сент Марте.

Основные характерные признаки штамма

Streptomyces canadiensis МКК1 3155, Свороносные волокна лрямые, ровные, описывающие лепкие колебательные,движения лишь случайно и только на некоторой части длины волокна или у его конца. Очень длинные, обычно превышают 100 м.

Str. canadiensis представляет собой аппар ат спор ообр азующих воздушных орта нов розовато-серого цвета. Его характерная ок,раска,ясно видна в некоторых крахмальных средах, где опорообразование протекает хорошо и может быть еще улучшено присутспвием земли.

Образует цилиндрические споры размером (0,4 — 0,6) X (0,8 — 1,2) мим.

Агар-агар Беннетта. Развивается хорошо.

Субстратный мицелий коричнево-желтый до светлого, Воздушный мицелий отсутствует.

Растворимый пигмент коричнево-желтый, светлый.

5 Агар-агар Эмерсона. Развивается хорошо.

Субстратный мицелий коричнево-желтый до светлого. Воздушный мицелий отсутствует.

Растворимый пигмент от;коричнввого до желтого светлого.

10 Агар-агар триптоновый. Субстратный мицелий коричнево-желтый, хорошо развит; воздушный,мицелий светло-сероватый; растворимый пипмент коричнево-желтый, темный.

Агар-агар глюкозо-пентоновый. Субстратный мицелий хорошо развит, коричнево-желтый, местами черноватый; воздушный мицелий отсутствует; растворимый пигмент коричнево-желтый, сероватый.

Питательный агар-агар. Степень развития

20 слабая. Обратная сторона колоний сероватожелтая, развитие слабое; воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Глюкозо-аспарагиновый агар-агар. Обратная сторона колоний коричнево-желтая, воз25 душный мицелий оветло-розовато-серый, растворимый пигмент светлый коричнево-желтый.

Глицерино-аспарагиновый агар-агар. Субстратный мицелий от светло-желто-коричнево30 го до светло-коричнево-желтого; воздушный

556732

3 мицелий светло-серый, слегка розоватый, умеренно развитый.

Агар-агар с малеатом кальция (Краииского). Развитие очень умеренное, обратная сторона, колоний от серовато-белого до желтовато-белого, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Агар-агар с тирозином. Степень, развития слабая. Субстратный мицелий от бесцветного до светло-серо-коричневого. Растворимый пигмент, коричневатый, светлый, малоинтенсивный.

Агар-агар с крахмалом. Развитие культуры очнь умеренное. Субстратный мицелий от серовато белого до желтовато-белого. Воздушный мицелий светлый, сероватый, умеренно развитый. Растворимый пигмент сероватокоричнево-желтый.

AI.ap-агар с крахмалом Гранди. Обратная сторона колоний коричнево-желтая, светлая; воздушный мицелий,светлый,,розовато-серый; растворимый пигмент коричневато-желтый-серый, Агар-агар с,крахмалом Придхэма. Развитие культуры хорошее. Субстратный мицелий коричнево-желтый. Воздушный;мицелий светлый розовато-серый, развитие умеренное. Растворимый пигмент серо-желтый, слепка коричневатый.

Синтетический агар-агар Чапека с глицерином, Развитие хорошее. Субстратный мицелий желто-коричневого цвета, хорошо раз витый. Растворимый пигмент довольно интенсивный, желтый, слегка коричневый.

Синтетический агар-araip Чапека с сахарозой. Субстратный мицелий хорошо развит, желто-коричневый.

Картофельная среда. Раз витие хоро шее.

Субстратный мицелий развит хорошо, от серовато-желтого до черновато-коричневого.

Воздушный мицелий от беловатого до розовато-серого, развитие умеренное. Растворимый пигмент в куске картофеля от желтовато-серого до черноватого, жидкость — светло-желтая.

Морковная среда. Степень развития умеренная. Су бстратный мицелий серовато-коричневато-желтый. Воздушный мицелий с беловатыми,полосами. Растворимый пигмент коричневый в моркови и желтый — в жи дкости.

Чистый желатин 12%-ный. Культура хорошо развита на поверхности в точке коатуляции. Обр тная сторона колошений чер новатокоричневая. Воздушный мицелий серый, хорошо развит. Растворимый пигмент коричневожелтый, начиная с поверхности и распространяясь,в зоне разжижения.

Бульон глюкоэно-нн1ратный Диммика.

Развитие .среднее. Образует кольцо и пленку от беловато-желтого до светло-желтого. Растворимый пигмент довольно обильный, светложелтый. Воздушный мицелий отсутствует.

Снятое молоко. А. При теипературе26 C— хороп1о развитое кольцо желтого цвета; воз5

4 душный мицелий и растворимый, пигмент отсучсввуют;

Б. При температуре 37 С вЂ” слабо развитое:кольцо коричнево-желтого цвета. Воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Желатин — медленное неполное разжижение.

Малеат кальция растворяет хорошо.

Тирозин — видимое растворение отсутствует.

Крахмал гидролизуется.

Положительная реакция нитрита в течение перовых 24 час.развития культуры, затем

15 быстро, переходящая в отрицательную.

Молоко, медленно пептонизируется без коагуляции при 26 С.

Сероводород не образует.

Оптимальная температура роста штамма

20 25 — 35 С.

Способ, получения а нтибиотика осуществляют следующим образом.

Культуру StI eptomyces canadiensis NRRZ

3155 выра шикают в глуби нных условиях в ферментационном аэробном процессе на пита. тельной среде, содержащий источники углерода и азота, минеральные соли и стимуляторы роста.

В качестве источника углерода можно использовать гидраты углерода, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, декстрины, крахмал, меласса, различные виды алкогольного caxagapa, органические кислоты — молочная, лимонная, винная, некоторые животные или растительные масла.

В качестве источника азота могут быть иопользованы нитраты, минеральные и органические соли аммония, мочевины, аминовые кислоты, а также казеин, лактальбумин, глю40 тен и их гидролизаты, мука соевая, рыбная и ирахисовая, мясные экстракты,,дрожжи.

Из минеральных солей питательная среда может содержать сульфаты, хлориды или фосфаты щелочных или щелочноземельных

45 металлов, кар бонаты кальция или магния, а также а кгиваторы роста — соли цинка, кобальта, железа, меди и марганца.

Ферментацию прэводят при температуре

25 — 35 С, рН среды 6,5 — 7,5 и скорости аэра50 ции 0,3 — 2 л/л мин. Максимальный выход антибиотика через 4 — 9,дней культивирования в за висимости от используемой среды.

Aíòè áèoòèê выделяют из культуральной жидкости известными приемами с учетом его физических, химических и 6иолотическнх свойств.

Активность антибиотика определяют методом диффузии, используя Staphylococcus auIeus 209 Р,в качестве тест-о рганизма.

60 Антибиотик 8.036 R. P. является сильной кислотой, нейтральный эквивалент которой

775 (рКа — 4,45).

Элементарный состав, /О. С 47,9; Н 7,1;

О 38,3; N 4,5; P 2,2.

65 Молекулярный вес выше 5000., 556732

Физические свойства. Аморфный белый порошок. Точка плавления 235 — 236 С с разложением, выше 180 С приобретает коричневую окр а ску.

УФ-опвктр, определяемый, начиная с раствора 50 мг/л, в воде (толщина 1 см), не имеет характерных максимумо в, коэффициент поглощения Х", ;и увеличивается от 0 до 40 в интервале от 400,до 210 нм.

Минимальная бактериостатическая концентрация, л кг/см

Вид бактерий

Staphylococcus aureus, штамм 209

P-ATCC 6538 P

Staphylococcus aureus, штамм 133

Staphylococcus aureus, штамм Смит

Sarcina lutea — ЛТСС 9341

Streptococcus faecalis — АТСС 9790

Streptococcus viridans

Streptococcus pyogenes hemolyticus, штамм Диг 7

Neisseria gonorrhaeae (А 50)

Neisseria miningitidis (5813)

Diplococcus pneumoniae, штамм Тиль

Bacillus subtilis — ATCC 6633

Bacillus cereus — АТСС 6630

Mycobacterium species — ЛТСС 607

Vtycobacterium para — smegmatis (А 75)

Escherichia coli — АТСС 9637

Shigella dysenteriae — Shiga L

Salmonella paratyphi А

Salmonella schottmuelleri (паратиф В)

Фоженс

Proteus vulgaris

Klebsiella pneumoniae — АТСС 10 031

Pseudomonds aeruginosa, штамм Васс

Brucella bronchiseptica (CN — 387)

Pasteurella multocida (А 125)

Treponeme de Reiter

0,95

0,50

1,00

70,00

) 250,00

1,10

0,01

0,60

0,60

0,08

30,00

0,01

5Î,0О

160,00

35,00

90,00

165,00

70,00

165,00

90,00

45,00

20,00

2,50

10,00

IR-спектр в бромистом калие представлен на чертеже, на котором по оси абсцисс с одной стороны нанесена .длина волн в микронах (нижняя плкала), а с другой стороны частота волн в GM (верхняя шкала), по оси ординат — оптические плотности.

Химические свойства. А нтибиотик 8.036

R. P. легко растворим в воде, диметилформамиде, пиридине, уксусной кислоте; малорастворим или нерасгворим в этаноле, ацетоне, хлороформе, н-гексане.

В 1%-ном водном растворе устойчив при рН в,пределах от 6,до 10.

Антибиотик дает отрицательные тесты при следующих реакциях: биуретовой, Миллона, Поли, Адамкевича, Эрлих-Салковского, на хлорное железо, ксантопротеи новой, на железистый малтол, Полленса, Мернера, Циммермана и Бито, диазотирования.

Дает положительные тесты при следующих реакциях: на нигридин (слабо положительную до гидролиза, очень сильную после кислотного гидролиза), Молиша, Фолен-Дени, Са кагучи после кислотного гидролиза, на перманганат калия до гидролиза (отрицательный тест после гидролиза), на динитро-2,4, на фенилги д разин после кислотного гидролиза, Фе0,006

До 370 (л) 55 Среду с рН 6,2 стерилизуют 40 мин барботированным паром при 122 С. После охлаждения объем бульона составляет 400 л, рН

7,1. Бульон засевают 40 л инокулята из ферментера 1.

60 Культура созревает 156 час |при 27 С и перемешивании турбиной, вращающейся со скоростью 260 об/мин, пои скорости аэрацич

1" ма/час, рН среды 7,25.

- Активность культуральной жидкости

65 1625 ед/см линга после кислотного гидролиза, реакциях

Биа lа, Таубера, Эльсона-Моргана после кислотного гидролиза, Дише и Боренфрейнда, Селиванов-Роэ, Пехмана, .реакции на сернистый индол, на цистеин-карбазол, на железосинеродистый калий и хлорное железо.

Бактериостатичеокую активность антибиотика 8.036 R. P. определяют методом разведе-ния. Результаты различных определений

l0 представлены в таблице, где минимальные бактериостатичеакие концентрации выражены в микрограммах вещества на 1 ом опытной среды.

Обладает высокой актианостью в отноше15 нии грамположительных микроорганизмов и некоторых грамотрицательных.

По своему действию он не перекрещивается такими антибиотиками, IKBK пенициллин, стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол, 2О спирамицин, карбомицин, эритромицин, lIlpHстинамицин и новобиоци н.

Антибиотик обладает большой продолжительностью,действия и слабой токсичностью.

П р н м е р 1. В ферментер 1 емкостью

25 170 л загружают (г):

NZ-а|мин типа E 1200

Мясной экстракт 720

Гидр атирова нная глюкоза 1200

Соевое масло 60 (мл)

ЗО Агар-агар 120

Вода До 150 (л)

После установления рН среды 705 добавлением 90 см 10 н. соды смесь стерилизуют

40 мин посредством барботирования паром при 122 С. После охлаждения объем бульона составляет 120 л, а рН вЂ” 6,9. Затем производят посев 200 см Streptomyces canadiensis, подготовленной в колбе Эрленмейера при перемешивании.

40 Культура развивается 32 ч при 27 С, постоянном перемешивании и аэрировании стерильным воздухом.

Производственную культуру получают в ферментере 2 емкостью 800 л, загруженном

45 питательной средой следующего состава (кг);

Отмоченная кукуруза 8,0

Гидратированная глюкоза 4,0

Соевое масло 8,0 (л)

Углекислый кальций 4,0

50 Сульфат аммония 0,4

Хлористый гексагидрат кобальта

Вода

556732

II p и м е р 2. Ферментер 2 с культуральной средой, описанной в примере 1, засевают инокулятом. Культивируют 156 ч при 33 С, постоянном первмешива нии тур битной с

160 об/мин и скорости аэрации 25 м /час. рН среды 7,45, объем сусла 340 л.

Активность культур альной жидкости

3215 ед/смз

П р и м ер 3. Культуральные жидкости, полученные по примерам 1 и 2, перемешивают. 740 л сусла с титром 2420 ед/см при рН

7,3 доводят до рН 2 добавлением 10 н, серной кислоты в ванне, оснащенной смесителем.

После этого вносят 18,кт фильтровальной добавки.

Смесь фильтруют через филь пр-пресс, и осадок от фильтрования промывают 250 л водопроводной воды. Фильтрат и неактивную воду отб1расывают. Остаток от филь рации ломещают при перемешивании в виде суапензии в 388 л смеси метанола (268 л) и воды (120 л). рН Суапензии доводится до 7,добавлением

10 н. соды.

Перемешива ние продолжается 1 час, а затем раствор фильтруют на фильтр-прессе.

Фильтрат отделяют, а осадок п ромывают

150 л 70 /о-ного метанола. Фильтрат и промыака составляют вместе 530 л с активностью 3400 ед/ом . Осадок выбрасывают. Алкогольный фильтрат концентрируют под пониженным давлением (20 мм рт. ст.) при 35 С до объема 5,2 л..

Антибиотик выпадает при добавлении

40 л этанола. Выпавший антибиотик отжимают, промывают этанолом, а .затем высушивают в сушильном шкафу под пониженным давлением (5 MiM рт. ст.). Получают 885 г светлосерого продукта с титром 1790 ед/мг. .Пример 4. 880 г неочищенного антибиотика, полученного в примере 3, растворяют в

20 л воды с рН 7. Водный .раствор фильтруют, затем провускают через колонку До чех (35 л) 1Х2 в хлористом цикле. Вытекающую жидкость удаляют. Смолу лромывают 80 л воды, затем 80 л смеси воды с муравьи ной кислотой (90: 10 по объему).,После этого промывают смесью метанол: вода: муравьиная кислота (80: 10: 10) и, наконец, смесью метанол: вода (80: 20).

Антибиотик извлекают после всех этих операций 300 л смеси метанол: вода (80:20), содержащей 10 г/л хлористого калия. Среднюю фракцию, объем которой 120 л, .концентрируют до объема 5 л под пониженным дав,лением (20 м м,рт. ст.) при температуре 40 С.

Концентрат диализируют 24 час против дистиллированной воды сквозь мембрану из ,регенерированной целлюлозы с целью удаления минеральных солей и различных орга нических загрязнений.

Диализирован ный раствор (6,8 л), содержащий весь извлеченный антибиотик, концентрируют под пониженным да влением (20 мм рт. ст.) до 0,8 л. К полученному, концентрату

l0 5

Зо

8 добавляют 5 равных ему объемов ацетона—

:выпадает калиевая соль антибиотика.

После фильтрации, промывки и просушки в течение одной ночи п|ри 35 С под давлением

2 мм рт. ст.,получают 195 г светло-коричневого .порошка с активностью 5680 ед/мг.

Пример 5. 175 г продукта, полученного по примеру 4, растворяют в 3 5 л воды с рН

7. Водный раствор пропуакают через (колонку До чех (15 л) 1Х2 в хлористом цикле.

Стекающую жидкость удаляют. С молу последовательно промывают в 15 л дистиллированной воды, 20 л смеси воды с муравьиной кислотой (90: 10 по объему), 40 л смеси метанол: вода: муравьиная кислота (80; 10: 10).

Антибиотик извлекают 75 л смеси метанол:

: вода (80: 20), содержащей 10 г/л хлористого калия.

Среднюю фракцию элюата (40 л) концентрируют до 1,1 л под пониженным давлением (20 мм рт. ст.) и температуре ниже 40 С, .концентрат диализируют в течение 24 час против дистиллированной воды через мембрану яз регенерироваиной целлюлозы.

Диализированный раствор, содержащий всю активность средней фракции (1,5 л), концентрируют под аониженным давлением (20 м|м рт. ст.) до объема 200 ом . К полученному концентрату добавляют 5 объемов ацетона для осаждения антибиотика в виде солей калия.

Выпавший осадок отжимают, промььвают ацетоном, просушивают в течение ночи при

3,5 С и паниженно:м давлении (2 мм рт. ст.).

Получают 98 r калиевой соли антибиотика в виде белого порошка с активностью

800О ед/мг.

При мер 6. 5 г калиевой соли антибиотика, полученной по лримеру 5, .с титром

8000 ед мг растворяют в 50 см смеси н-лропанол: вода (50: 50). Раствор поступает в колонку, содержащую в суопензии окись алюми ния с рН 4 в смеси н-,про,панол: вода (75; 25).

Антибиотик извлекают из смеси порциями по 200 см н-,пропанол:вода (50: 50), затем по 200 см н-лропанол: вода: концентрированный аммиак (d = 0,925) (50: 49,5: 0,5 по объему).

Вытекающая жидкость поступает частя ми по 10 ам, и активность каждой части определяют биологической дозировкой.

Обогащенные фракции элюата н-пропанол: вода (50: 50), фракции от 3-ей до 11-ой соединяют вместе и концентрируют при пониженном давлении (20 мм рт. ст.) и температуре не выше 40 С до объема 10 см .

Концентрат разводят 10 ом,н-пропанола и

10 омз ацетона для осаждения антибиотика.

После фильтрации, промывки ацетоном и просущки в течение ночи при 35 С и пони. женном давлении (2 мм рт. ст.) получают

2,4 г калиевой ооли антибиотика с активностью 9150 ед/м.г.

Обогащенные фракции элюата н-пропанол:

556732

800 750 700 0/ч

100 Яа

0,0 о,г

o,Ф

06

og

1,5

5 Ф 5 6 7 8 3 10 11

Составитель T. Смирнова

Техред М. Семенов Корректор Л. Денискина

Редактор Н. Хубларова

Заказ 5806

Изд. № 586 Тираж 563 Подлисное

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская,наб., д. 4/5

МОТ, Загорский филиал

: вода: концентрированный аммиак (50: 49,5:

: 0,5), фракции от 23-ей до 40-ой, соединяют .вместе и обрабатывают вышеописанньим опосо бом.

Получают 1,5 г слабо окрашенного порошка с актвиностью 8500 едlмг.

Формула изобретения

Способ получения антибиотика, о т л и ч а10 ю щи и с я тем, что культуру Streptomyces canadiensis NRRL 3155 выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, с последующим выделением и очисткой целевого продукта известными приемами.