Способ получения -галактозидазы

Способ получения -галактозидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАУЕНМУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 27.01.75 (21) 2104276/13 (51) М. Кл. С12 о 13/10 (23) Приоритет — (32) 28.01.74 (31) 437536 (33) США (43) Опубликовано 05.05.77. Бюллетень №17 (53) УДК 577.15.07 (088.8) (46) Дата опубликования описания 23.12.77

Государственный комитет

Соввтв Министров СССР по делам изооретений и открытий (72) Авторы изобретенияИностранцы

Сигееси Нарита, Хиросуке Наганиси, Чикаси Изуми, Акиеси и Масару Ямада (Япония)

Иностранная фирма

"Хоккайдо Шугар Ко, ЛТД" (Япония) Екоюян (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а — ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

Изобретение относится к технологии получения а - галактоэидазы микробиологическим синтезом.

Известен способ получения a - галактозидазы путем культивирования плесени, в частности

Mortirella vinacea ATCC 20034 на питательной среде (11

Фермент а ° галактозидаза обладает способностью гидролизовать раффиноэу, которая содержится в мелассе свеклосахарного производства и затрудняет процесс кристаллизации сахарозы. По этой причине в ходе производства свекловичного сахара к свекловичной мелассе добавляют агалактозидазу, которая гидролизует раффинозу с образованием при этом сахарозы и галактозы.

l5

С целью повышения выхода фермента и его активности согласно предлагаемому способу для получения а - галактозчдазы используют штамм плесени Circinella muscae (Her lese et 4е Toni) nova

typica coreanus (АТСС 20394). 20

Получаемый согласно изобретению энзимный агент (мицелий, содержащий энзимы — a - галактозидазу и инвертаэу) обладает высокой активностью относительно а - галактозидазы и слабой активностью в отношении инвертазы. И

Плесень Circinella muscae (Ser lese et de Toni }

nova typica coreanus была выделена из отжатой после фильтрования массы корейских дрожжей.

Спорангиофоры, выращенные на синтетической атаровой среде "lgucor", имеют светло-коричневый цвет и вырабатывают симподиальные ответвления по мере старения. Их выступающие передние окончания образуют закрученные спирали, обращенные вниз, имеющие единичные спорангии, произрастающие на концах каждой спирали. В нетипических случаях поблизости от спорангии ответвляются стерильные иглы, которые отделены перегородками.

Основные и разветвленные спорангин имеют незначительные разли ия между собой по размеру: диаметр первых 8 — 10 мк, диаметр вторых 4 — 6 мк.

Спорангии имеют сферическую или слегка сплюснутую псевдосферическую форму, их протяженность

30 — 65 мк по диаметру. Спорангии имеют белый цвет, постепенно переходящий в темно-серую окраску по мере созревания. По результатам наблюдения спорангии имеют изменяющиеся размеры по диаметру: небольшие — около 20 мк, крупные достигают до 80 мк. Поверхность стенок спорангии

;легка шароховатая прерывистая и зачастую сохра557762 няет воротнички в виде чашечек в нижней час ти столбиков. Средний размер столбиков

N — 30,х 30-40 МК, столбики различнои формы (овальная, коническая, грушевидная и прямоугольная). Некоторые из них имеют гладкую поверх. ность, другие — неопределенное число бугорков и возвышенностей. Все они приобретают светлосерую окраску.

Спорангиофоры имеют гладкую поверхность, их диаметр 4 — 6 мк. Отдельные экземпляры окраски практически не имеют, в виде гроздьев, их окраска становится от темно-серой до черной.

Наблюдается pbct хламидоспор или цигоспор, Микроскопическое наблюдение показывает, что рост мицелия на синтетической агаровой среде

"Мукор", на агаровой среде, содержащей картофель и декстрозу, и на агаровой среде, содержащей солодовый экстракт, сначала характеризуется по внешнему виду появлением образований, напоминающих войлок, цвет которых изменяется от бело- щ

ro до темно-серого или черного по мере созревания спорангий. Ве1.хняя часть старых культур покрыта светло-коричневыми спо ангиофорами, грязными по внешнем„виду. Это вызывается ростом светлокоричневых спорангиофор, достигающих размера д

5-7 мм. В этой среде не образуется растворимый пигмент.

Плесень, используемая по предлагаемому способу, была принята ATCC для закладки 7 января

1974 г с обозначением "АТСС 20394". Она вырабатывает энэимы с явно выраженной высокой активностью в отношении а - галактоэидазы и слабой активностью относительно инвертазы в случае культивирования на среде, содержащей источники угле35 рода, азота, неорганические соли и вещества, возбуждающие образование знзима, обычно прИменяемые для культивирования плесени.

В качестве источников углерода, применяемых для приготовления среды, используют крахмал, 4О глюкозу, глицерин, мальтозу, декстрин, сахарозу и инвертированную мелассу, источников азота соевую муку, измельченные дз лорошкообразного состояния земляные орехи, измельченные семена хлопчатника, жидкость, полученную после вымачи, вания кукурузных початков, мясной экстракт, пелтон, экстракт, полученный из дрожжей, нитраты и соли аммония. В среду вносят также органические соли — хлористый натрий, хлорпстый калий, сернокислый магний, сернокислый марганец, сернокислое железо, фосфаты и углекислый кальций, а также лактозу, ее промежуточные продукты, раффинозу и мелибиозу.

Условия культивирования указанной плесени аналогичны обычным условиям культивирования 55 плесени в аэробных условиях.

В приготовленную из указанных компонентов среду инокулируют плесень рода Ci rci ne I la, во время культивирования среду встряхивают в аэробных условиях в течение 40-72 час. Процесс ведут при рН среды на уровне 5-8 при температуре около

30 С. В результате культивирования плесени в мицелии вырабатывается а - галактозидаза с очень высоким выходом, В связи с тем, что мицелий имеет форму зерен он легко поддается отделению от жидкости для культивирования посредством фильтрования. Отделенный мицелий промывают водой.

Полученным энэимным агентом, имеющим вид мицелия в форме зерен, заполняют реактор вертикального или горизонтального типа. Затем через него пропускают мелассу. Во время прохождения мелассы энзимный агент действует на раффинозу, содержащуюся в мелассе, и гидролизует ее да сахарозы и галактозы.

Активность а- галактозидазы, полученной по предлагаемому способу, выше, чем полученной по любому известному, и она может обеспечить эффективную обработку мелассы более высокой концентрации или же в большем количестве (по сравнению с а - галактозидаэой, полученной известным способом) .

Для сравнения готовят среду путем растворения 1,0/лактоэы; 1,0% глюкозы; 0,3% сульфата аммония; 0,5% дрожжевого экстракта; 0,5% пептона; 0,2% К, НРО4, 0,05% MgSO4 7Н20; 0,002%

MgSO4 6Í2O и 0,001% FeSO4 7Н20, В полученный раствор добавляют гидрат окиси натрия до значения рН среды 5,8, после чего вводят 0 3% углекислого кальция, Приготовленную среду стерилизуют. Каждую из следующих плесеней: Mortirella vinacea (АТСС 20034) Absidia ref lexa van Tieghem (IFo

5874), Circinella muscae (Sorokine) Berlese et de

Toni (Circinella sydowi Leudner ) (1Fo 4457) и

Gircinella muscae (Sorokine) Berlese et de Toni (С.W. Hesseltine 1FO 6410) ипокулируют по предлагаемому способу в виде суспензии спор (в количестве 2 х 10а спор) в среде объемом 200 мл.

Процесс культивирования ведут при 30 С в течение

48 час, Во время культивирования среду встряхивают со скоростью 132 o6/мин. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Содержащий энзим мицелий, полученный путем культивирования плесеней, применяют для обработки мелассы свеклосахарного производства. Выяв. ленная зависимость между концентрацией мелассы и добавляемым количеством мицелия показана в табл. 2.

Иэ табл. 2 видно,что для эффективной обработки мелассы, характеризуемой 20 Брикса, содержащей 3,84 г раффиноэы, требуется 1152 х 10" ед. а .галактозидазы. В случае использования Mort irel la

vinacea (АТСС 20034)необходимо 4,84 г энзима (по сухому основанию) в связи с тем, что активность а- галактозидазы составляет 238 х 10 ед.

При применении Absidia ref lexa (I Fo 5874), характеризуемой активностью по а - галактозидазе, равной 532.10 ед, требуется 2,17 г энзима (по сухому основанию). Плесень по изобретению имеет активность по а - галактозидаэе 1246 х IO ед.

Следовательно, для данной цели достаточно 0,93 r энзимного агента. Это различие в количестве тре557762

50 буемого мицелия увеличивается по мере увеличения индекса Брикса обрабатываемой мелассы, При использовании Mortirella vinacea (ATCC 20034) для одработки мелассы, имеющей 60" Брикса, требуется 14,52 r мнцелия, в то время как в случае применения предлагаемой плесени достаточно 2,77 r мицелия, что составляет примерно 1/5.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение энзимного агента, имеющего более высокую активность по отношению к а - галактоэидазе (на весовое количество), в результате чего подбор концентрации для подлежащей обработке мелассы можно осуществить значительно проще, а количество расходуемого энзимного агента уменьшить. Это повышает экономический эффект. Кроме того, энзимный агент характеризуется меньшей активностью в отношении инвертазы, которая стимулирует гидролиз сахарозы.

Пример 1. В ферментатор емкостью 20л помещали 15л среды, содержащей 1% глюкозы;

0,2% пептона; 0,05% КН Р04, 0,05% MgS047H O и 1280 ч/млн противовспенивающего средства "Коколин", доводили значение показателя рН среды до

5,5 и стерилизовали. Плесень Circinetla muscae (АТСС 20394) в форме суспензии спор инокулировали в среду при соотношении 1 х 10 спор на

10м среды н культивировали при температуре

30 С в течение 19 час, причем среду аэрировали посредством подачи воздуха в количестве 1/2 об./об,мин(v, v. m,) и перемешивали со скоростью

240 об./мин. Полученный мнцелий в количестве

400 лкл переносили в ферментатор емкостью 20 л и инокулировали в 15 л среды, имеющей тот же самый состав, что и состав среды, укаэанной выше.

Культивирование проводили в условиях аэрации путем подачи воздуха в количестве 1/4 об./об.мин (v.v,m) и прн перемешивании со скоростью 350 об/мин до тех пор, пока остаточное содержание сахара в среде не достигло 0,1% (определение сахара вели по способу Somogyi), Общий период времечки, характеризующий данную культуру, приведен в табл. 3.

Пример 2. Гртовили среды, каждая из которых имела следующий состав: глюкоза 1,0% Ю дрожжевой экстракт 0,5%; пептон 0,5%; сульфат аммония 0,3%; КН РО4 0,2%; MgSO4 7Н О 0,05%; сульфат марганца 0,002%; сульфат железа 0,001% на

1% сахарида, выбранного из группы сахарндов, указанных в табл. 4. Значения показателя рН сред доводили до 5,8. Порцию каждой среды в 100 мл помещали в колбу емкостью 500 мл и стерилизовали. Плесень по изобретению в виде суспензии

45 спор инокулировали в среду, содержащуюся в каждой колбе в количестве 5 х 10" спор и культивировали (при темперагуре 30 С в течение 72 ас, причем перемешивали со скоростью 136 об/мии).

Полученные результаты приведены в табл. 4.

Пример 3. Мелассу разбавляли водой до

30 Брикса и доводили рН среды до значения 5,2 посредством серной кислоты. В 200 г полученного раствора (содержащего 5,8 г раффиноэы) вводили энэимный агент, выработанный плесенью по изобретению (имеющий сухой вес 1,39 г и 17300 000 ед. агалактозидазы), полученный по примеру 1, и оставляли для прохождения реакции при температуре 50 С на 2 час 30 мин при встряхивании. К концу реакции энэимный агент отделяли фильтрованием и промывали водой, Фильтрат соединяли.

Опеределенный объем этой смеси анализировали ло методу бумажной хроматографии для определения содержания остаточной раффинозы и возросшего содержания сахароэы. Точнее, образец проявляли в растворителе, состоящем из 6 ч. и - бутанопа, 4 ч. пнридина и 3 ч. воды. Зону раффиноэы и эолу сахарозы, образовавшиеся последовательно, обрезали, промывали водой н анализировали по цистеинкарбаэольному способу. Найдено, по 79% первоначально содержавшейся раффиноэы было разложено, а содержание сахарозы увеличилось на 2,45 г.

П р и ме р 4. В 200 г малассы, имеющей 30 Брикса как указано в примере 3, вносили мипелий нз предлагаемой плесени (имеющий 17300000 ед. активности по а - галактозидазе) и вели реакцию аналогично примеру 3. После реакции энэимный агент промывали водой, добавляли к новой порции разбавленной мелассы и снова проводили реакцию.

Таким образом, энзимный агент применяли повторно во время 5 обработок. Растворы, полученные после всех обработок, анализировали на содержание остаточной раффинозы и на возрастающее содержание сахарозы. Результаты приведены в табл, 5.

Пример 5, Свекольную мелассу разбавляли до 50 Брикса и устанавливали рН ее 5,2, добавляя серную кислоту. В 200 r этого раствора (содержагцего 9,60г раффинозы) вносили энзимный агент, выработанный предлагаемой плесенью (имениций сухой вес 2,31 rиактивность 28800000 ед,,по агалактозидазе), полученный по примеру 1. Реакцию проводили при температуре 50 С в течение 2час

30 мин. По окончании реакции раствор, содержащий продукты разложения, анализировали, определяя степень гидролиза раффинозы и увеличение .содержания сахарозы. Найдено, что степень гидролиза 57,1%, а прирост содержания сахарозы — 3,06г.

557762

Таблица1.

Предлагаемая

4437

1,40 33300

18750

110

8338

1,41

489 10"

69000

8383!

8750

Таблица 2

3,84

0,925

4,840

2,165

5,75

1,387

7,261

3,848

7,68

1,849

9,681

4,331

9,60

2,311

12,101

5,414

60 11,52

2,774

14,521

6,496

Mortirella vinscea (АТСС 20034) Absidia ref lexa i (I FO 5874) Clrcinelta muscse (1 FO 4457) Clrcinel la muscae (1FO 6410) 1,42 177000 1246 104 63

238 10 " 263

1,4! 75000 532 10

1,36 42000 309 10"

557762

Таблица 3

6,4

5,5

23530

6,7

54300

6,9

81450

6,9

132130

153000

6,4

177380

6,2

12,93 х 10 181000

6,3

0,09 i

1,40

240 х 10"

32400

1,35

Галактоза

0,07

1,37

0,06

171000

1,48

0,09.370 х 10"

1,07

0,05

Раффиноза

Мелибиоза

Лактоза ь

6,7

Таблица 4

248 х 10"

1155 х 104

557762

Таблица 5

° галакто91

79,0

2,50

79,5

78,0

2,46

77,0

2,42

75,8

2,45

Способ получения а - галактозидазы путем культивирования плесени на питательной среде, о т л иийющийся тем,что,сцельюповышениявыхода и активности фермента, используют штамм плесени

Составитель М, Андреева

Техред М Левицкая Корректор А. Власенко

Редактор Л. Ушакова

Заказ 939/67

Тираж 541 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Фор мула изобретения

Circ inel la muscae (Ber lese et de Toni) nova typica coreanus (ATCC 20394) „

Источники информации, принятые во внимание ври экспертизе: !. Патент США 1те 3647625, кл. 195-11, 1972.