Штамм (вниигенетика энто-77)

Штамм (вниигенетика энто-77)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

щ 5Я730

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ У

Союа цоевтских .

Соцналистнчесщ

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 10.04.74 (21) 2018892/15 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 15.06.77. Бюллетень № 22

Дата опубликования описания 01.11.77 (51) М. Кл. С 12К 1/00

А 01N 15/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДK 63: 576.8 (088.8) во делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

С. И. Алиханян, Н. Д. Ломовская, А. Н. Майсурян, В. И. Звенигородский, И. С. Изаксон, М. Л. Мысловатая и Т. Г. Столярова

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (71) Заявитель (54) ШТАММ BACILLUS THURINGIENSIS VAR. GALLERIAE (ВНИИгенетика ЭНТО-77) Изобретение относится к промышленной микробиологии, в частности касается получения промышленных штаммов микроорганизмов для производства энтомопатогенных бактериальных препаратов, а именно энтобактерина. Препарат энтобактерин находит широкое применение в сельском хозяйстве для защиты растений от насекомых вредителей.

Известны природные штаммы спорообразующих кристаллоносных бактерий Вас. thuringiensis, п родуцирующие энтомоцидные токсины.

В настоящее время известно использование в промышленном производстве энто бактерина

Вас. thuringiensis galleviae 11-67.

Основным недостатком этого штамма является его чувствительность к фагам g> и gs, встречающимся в производстве, приводящая к фаголизису, что делает производство неэффективным и малорентабельным.

Целью изобретения является создание такого штамма — продуцента, который обладал бы устойчивостью к фагам g и д, наиболее часто встречающимся в производстве. Цель достигается тем, что в результате селекции по признаку устойчивости к фагам g1 и g8 при обработке клеток природного фагочувствительного штамма Вас. thuringiensis v. galleriae 11-67 раствором N-метил-N -Nitro-N нитроизанидина по методу Адельберга и др., получают новый штамм ВНИИгенетика 77.

Исследуемую культуру принимали как устойчивую к фагам g> и д, если при высеве на газон с данной культурой фагов в титре

5. 10 — 1-10 частиц/мл негативные колонии не образовывались.

Культурально-морфологические свойства штамма ВНИИгенетика ЭНТО-77.

М о р ф о л î r и я. Штамм ВНИИгенетика

ЭНТО-77 представляет собой грамположительную палочку с перитрихиальным типом жгутикования, активно подвижную, размером: длина 4 — 7 мкм, средний — 5,5 мкм, ширина 0,5 — 0,6 мкм. Клетки 24-часовой бульонной культуры с закругленными концами соединены в цепочки. Споруляция начинается через 24 — 39 ч. При этом образуются субтерминальные споры эллиптической формы с малым диаметром 0,9 мкм и большим диаметром 1,2 — 1,5 мкм и параспоральные включения неправильной формы.

Культуральные и физиологические признаки.

На мясо-пептонном агаре (МПА) при ин25 кубацип в течение 6 сут при 28 — 30 С образуются мелкие колонии диаметром 2 — 3 мм, круглые, с четким краем и матовой поверхностью. Среди основной массы мелких колоний встречаются колонии более крупные, с

30 частотой приблизительно 1%. Центр колоний

561730

Таблица 1

Культуры бактерий

Фаги штамм ЭНТО-77 штамм 11-67

5 Посев уколом. Рост по уколу в МПА rcoipневидный по всей длине и по поверхности.

В мясо-пептонном бульоне при 28 — 30 С в первые 3 сут мутность суспензии умеренная, в последующее время на поверхности бульона

10 по границе со стеклом появляется слабый рост. При стоянии образуется осадок белого цвета.

На ломтиках картофеля штрих влажный, блестящий. Пигмент на картофеле не о бразу15 ется.

0,0000001

0,0001

1,0

1,0

Таблица 2

Варианты опыта

Культуры бактерий

До инкубации

После инкубации

1 10"1 . 1010

Штамм 11--67

1 10 1 10"

До инкубации

После инкубации

Штамм ЭНТО-77

1 10

1.102

1..10а

1 10"

На мясо-пептонной желатине (МПЖ) растет медленнее, образует колонии белого цве- З0 та диаметром 1 — 2 мм, с гладким краем, матовой поверхностью и плоским профилем, Полное разжижение желатины происходит на пятые сутки. При этом на поверхности образуется матовая тонкая пленка. При посеве з5 уколом в МПЖ рядом с уколом образуются комки.

Таблица 3

Штаммы

100

11-67

ЭНТО-77

В и охи м ич еск и е свойства. 50

Крахмал гидролизует. Клетчатку не усваивает. При добавлении суспензии клеток в молоко оно начинает свертываться через 10 ч.

В момент свертывания pH=6,75. На моркови

55 не растет.

Углеводы.

Глюкозу усваивает. Сахарозу, маннозу, галактозу, маннит, лактозу и глюкозу не сбраживает. Нитраты не использует. Келатину разжижает.

Антигенные свойства.

Выявление антиген ных свойств штамма

ВНИИгенетика ЭНТО-77 с использованием преципитирующих сывороток подтверждает его идентичность серотипу Y. вьгпукльгй, цвет белый. Посев штрихом. При инкубации в течение 6 сут при 28 — 30 С на

МПА штрих растет умеренно, форма штриха корневидная, поверхность матовая, гладкая, профиль плоский, штрих непросвечивающий, Выживаемость гусениц (%) при концентрации спор, млй/мл консистенция тягучая, запах слабый специфический, окраска питательной среды не изменяется.

Титр фагов (количество фаговых частиц в 1 мл) Антагонистические свойства не проявились по отношению к Вас. subtilis, Вас, micoides, Вас. thuringiensis var, galleriae 11-67, Вас.

thuringiensis var. dendrolimus, Вас. thuringiensis var. insectum, Staphylococcus aureus, Actinomyces griseus, Candida.

Хранить штамм рекомендуется в виде лиофильно высушенной культуры в стеклянных запаянных ампулах.

Лабораторный а нализ показал, что на новом мутантном штамме фаг gi практически не развивается как iHa твердой, так и на жидкой питательных средах, а фаг оа на твердой среде не образует негативных колоний. В жидкой среде развитие фага g8 ограничивается по сравнению со штаммом 11-67 в 10 ;раз.

Эффективность титрования фагов g< и ga ,на твердой среде приведена в табл. 1.

Развитие фагов gi и g8 в жидкой питательной среде приведено в табл. 2.

Обработка бактерий мутагенами, в частности нитрозоизанидином может привести к изменению токсических свойств штамма. Табл.

3 показывает, что токсические свойства нового штамма сравнимы со свойствами исходного штамма 11-67.

Пример использования штамма ВНИИгенетика ЭНТО-77 для промышленного производства препарата энтобактерина.

Подготовка посевного материала.

Исходную культуру штамма выращивают в течение 6 сут в пробирках на скошенной ага ризованной среде следующего состава 1;

Мясной бульон, л 1

Пептон, r 10

NaCl, r 5

Агар-агара, % 2 рН среды 7,5 — 7,8.

561730

2 — 2,5 (40 — 50 мг /в аминного азота в среде) Таблица 4

Количество фаголизисных ферментаций при использовании природных штаммпв и нового штамма ЭНТО-77 в качестве продуцентов

Количество ферментаций

Число фаГОлиаисн61х операций, о, Емкость ферментеров, м

Штамм из них фаголизисных общее

150

37

Природные штаммы

ЭНТО-77

150

3 — 5

5 — 7

Формула изобретения

Шестисуточную культуру петлей переносят с косяков в колбы емкостью 500 мл с дрожжеполисаха ридной средой по 50 мл в каждой.

Состав дрожжеполисахаридной среды может быть в двух вариантах (2а или 26).

Состав среды 2а, вес. %..

Кукурузный экстракт

Гидролизат кормовых дрожжей 18

Глюкозобелковый концентрат 2

Са С12 0,05

Состав 26 отличается от состава 2а. Вместо глюкозобелкового концентрата используется крахмал в количестве 2 вес. %.

Засеянные колбы подращивают на качалках при 180 — 200 об/мин в течение 48 ч при

28 С до полной споруляции. После этого с помощью аппа1рата Боброва посевной материал из колб передается в ферментеры со средой 2а или 26.

Ферментация. Процесс выращивания культуры в ферментерах ведут при следующих условиях:

Температура, С 28 — 30

Расход воздуха, л/л среды в минуту 1

Непрерывное перемешивание при помощи мешалки

Давление в ферментере, атм 0,4 — 0,5 рН ферментационной среды 7,5 — 7,8

В процессе выращивания через каждые

8 ч из ферментера отбирают пробы для микШтамм Bacillus thuringiensis чаг. galleriae (ВНИИгенетика ЭНТО-77). Хранится в коллекции Всесоюзного научно-исследогательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов, регистрационный номер 980. Штамм является продуцентом препарата энтобактерина, активного по отношению к гусеницам Galleriae mellonella.

Морфология:

Грамположительные спорообразующие палочки размером: длина 4 — 7 мкм, средний— робиологического и биохимического контроля развития культуры.

Гашение пены производят путем дозированной подачи стерильного пеногасителя.

Выращи ванне культуры в ферментере продолжается 30 — 35 ч. Процесс прекращаютпо заключеншо микробиолога при условии наличия в культуральной жидкости 20 — 40/в свободных спор и кристаллов.

Приготовление препарата энтобактерина.

Концентрирование культуральной жидкости осуществляют на сепараторах. Сушку полученной пасты производят методом распыления в потоке горячего воздуха на распылительной сушильной установке. Из высушенного просеянного продукта отбирают среднюю пробу для определения кратности разбавления. Кратность разбавления наполните20 лем устанавливают, исходя из определения наименьшей концентрации разбавленного продукта, вызывающего гибель не менее 50% испытываемых гусениц Galleriae mellonella на шестые сутки опыта. Для усреднения пре25 парата используют наполнитель — каолин.

Использование штамма ВНИИгенетика

ЭНТО-77 для производства энто бактерии а позволяет осуществлять крупнотоннажное

30 производство этого препарата, что невозможно при использовании природных штаммов— продуцентов из-за частых фаголизисов.

Свойство фагоусгойчпвости нового штамма

ВНИИгенетика ЭНТО-77 позволяет снизить

35 количество фаголизисных ферментаций до

3 — 5%. Это видно из данных заводских испытаний, представленных в табл. 4.

5,5 мкм, ширина 0,5 — 0,6 мкм. Подвижные.

Встречаются в виде цепочек. В клетках образуются споры эллиптической формы с диаметром 0,9 — 1,5 мкм и кристаллические включения неправильной формы. Споруляция начинается через 24 — 39 ч.

С0

Культуральные и физиологические признаки,.

На мясо-пептонном агаре (МПА) образуются мелкие круглые с четким краем коло65 нии диаметром 2 — 3 мм с частотой =1% выщепляются более крупные колонии R-формы.

561730

Составитель С. Кудрявцева

Тех ред 3. Таранов ко Корректор Л. Денискина

Редактор Т. Девятко

Заказ 2789/13 Иад. ¹ 554 Тира>к 560

1-1ПО Государственного ко:.;птста Совета Министров СССР по дслаги изобретений н открытий! 13035, Москва, )1(-35, Раугпская нао., д. 4/5

Подписное

Тнпогра<1п я, пр. Сапунова, 2

Центр колонии выпуклый, цвет белый. Штрих на МПА у шестисуточной культуры корневидный, гладкий, с матовой поверхностью.

Окраска питательной среды не изменяется.

Запах слабый специфический. Посев уколом.

Рост по уколу в МПА корневидный по всей длине и по поверхности. Оптимум роста при

28 — 30 С. В мясо-пептонном бульоне при 28—

30 С в первые 3 сут мутность суспензии умеренная. На поверхности бульона появляется слабый, рост. При стоянии образуется осадок белого цвета. На картофеле пигмент не образуется, штрих влажный, блестящий.

На мясо-пептонной желатине (МПФТК) растет медленнее, образует колонии белого цвета диаметром 1 — 2 мм, с гладким краем, матовой поверхностью и плоским профилем.

Полное разжижение желатины п|роисходит на пятые сутки, при этом на поверхности образуется матовая тонкая пленка. При посеве уколом в МПЖ рядом с уколом об разуются комки.

Биохимические свойства.

Крахмал гидролизует. Клетчатку не усваивает.

Нитраты не использует. Молоко пептонизирует через 10 ч.

На моркови не растет. Желатину полностью разжижает.

Отношение к углеводам: глюкозу, мальтозу и галактозу усваивает, сахарозу, маннозу, галактозу, маннит, лактозу и глюкозу не сбраживает.

15 Антигенные свойства.

Идентичен серотипу Ч. Антагонистические свойства не обнаружены. Устойчив к фагам

gi и да, В течение 30 — 35 ч в жидкой регламентной среде образует до 2,5 10 спор и

20 кристаллов на 1 мл.