Способ получения противоящурной гоа2 формолвакцины из лапинизированного вируса
Патент 561732
Авторы
Способ получения противоящурной гоа2 формолвакцины из лапинизированного вируса
Иллюстрации
Реферат
пц 561732
ОПИСАН И Е
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.07.75 (21) 2153181/15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (51) М. Кл з С 12К 5/00
А 61К 39/26
Государственный комитет
Совета Министров СССР оа делам изобретений и открытий
Опубликовано 15.06.77. Бюллетень М 22
Дата опубликования описания 27.09.77 (53) УДК 616.988.43:
: 615.371/372 (088.8) (72) Авторы изобретения
А. И. Дудников, Н. С. Мамков и P. В. Мамкова
Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОЯЩУРНОИ
ГОЛ-ФОРМОЛВАКЦИНЫ ИЗ ЛАПИНИЗИРОВАННОГО ВИРУСА
Изобретение относится к способам изготовления биологических препаратов для вакцинации сельскохозяйственных животных и. может быть использовано в биологической промышленности для получения авирулентной, безвредной и высокоиммуногенной противоящурной вакцины.
Известны способы изготов ения противоящурной гидроокисьалюминиевой формолвакцины из афтозного, культурального и лапинизированного вируса (11. Известная технология изготовления протпвоящурной вакцины из лапинизированного вируса включает следующие операции: приготовление вируссодержащей суспензии, сорбцию вируса на гидроокись алюминия с последующей инактивацией формалином и теплом. B качестве дополнительного адъюванта применяется сапонич.
Противоящурная вакцина из лапинизированного вируса, изготовленная указанным способом, отличается слабой иммуногенностью и в большинстве случаев создает у привитых животных недостаточно напряженный иммунитет. Многочисленные попытки усовершенствовать вакцину не увенчались успехом.
Известен также способ изготовления противояшурной ГОА-формолвакцины из лапинизированного вируса, используемый биологической промышленностью СССР и являющий=я наиболее близким по технической сущно2 сти к предлагаемому способу (2). Вируссодержащую суспензпю готовят из тушек 2 — 3 дневных крольчат на 1/15М фосфатном буфере в отношении 1: 10. После размола и экстрагирования в суспензию добавляют 5 /о хлороформа, который тщательно эмульгируют в суспензии с помощью коллоидных мельниц, Хлороформ и денатурированные белки удаляют сепарированием или центрифугированием.
Затем вирус ящура двукратно концентрируют сорбцией на гидроокиси алюминия. Суспензию гидроокиси алюминия готовят на дистиллированной воде. Процесс концентрации вируса ящура на гидроокпси алюминия контролируют проверкой сорбппп вируса и комплементсвязывающего антигена. Концентрация считается полной при сорбции вируса не менее 99% и комплементсвязывающего антигена не менее 90%. После этого постепенно добав20 ляют 5 р-ный раствор формалина при постоянном перемсшивании. Инактивацию вируса ведут при 25 — 26 С в течение 48 ч. После окончания инактнвации в реактор добавляют под давлением глицерин, 10%-ный раствор
25 хинозоla и 10о/0-ный раствор сапонина. Все компоненты перемешивают в течение 30 мин, рН вакцины устанавливают в пределах 7,6—
7,8 путем добавления (1 или 5%-ного) раствора химически чистой соляной кислоты. Вак30 цину охлаждают до 4 — 6 С. Основным недо561732 рассасывается на
Таблица 1
Иммуногенная активность ГОА-формолвакцины, изготовленной на различных растворах
ИМДБО для мышей, мл опыты
Растворы
М+м
1П
Хенкса+0,5% ГЛА
Эрла+0,500 ГЛА
Тироде-+0,5% ГЛА
Дульбекко+0,5 ГЛА
Фосфатиый буфер
0,12
0,10
0,11
0,13
0,60
0,13
0,14
0,11
0,15
0,36
0,12 0,01
0,12 0,02
0,11 0,01
0,16 0,04
0,48-,-0,07
0,12
0,12
0,12
0,19
0,48 статком Г(рОтив01(щурной вакциньl из . Iапинизированного вируса и в особенности типа О, изготовленной на 1/15М фосфатном буфере, является то, что DF12 обладает весьма низкой иммуногенной активностью, не создаст продолжительности иммунитета у ссльскохозяйственных животных и при многократном применении вызывает большие трудности, С целью повышения иммуногенной активности противоящурной ГОЛ-формолвакцины из лапинизированного вируса, предлагают в известном clloco0c изготовления противоящурной ГОЛ-формолвакципы из лапинизпрованного вируса, включающем операции культивирования вируса, приготовление вируссодержащей суспензии, ее экстрагирования и эмульгирования, очистки вируса, добавления гидроокиси алюминия для сорбции вируса и
его инактивации, вируссодери<ащую суспснзиlо ГотОВить на солсВОм изотони (сском растворе, например, Хенкса, Эрла, Тироде или
Дульбекко с добавлением 0,5% гидролизата лактальбумина или казсина. При этом гидроокись алюминия добавляют к вирусу после очистки, предварительно приготовленную а солсвом пзотоничсском растворе Хснкса.
Противоящур ая ГОЛ-формолвакцнпа, полученная предлагаемым cllocoooivf, прсвышаст в 2 — 4 раза по активности вакцину, приготовленную известным способом, Высокая иммуногенность вакцины, полученной предлагаемым способом, по мнению авторов изобретения обусловлсна те vl, что в процессе инактивации сохраняются антигснные и иммуногснные свойства вируса за счет стабилизации сго солями кальция, магния и аминокислот гидролизатов,,находящихся в солсвых изотонических растворах. Кроме того, вакцина, полученная предлагаемым способом, не обладает
Из таблицы 1 следует, что ГЛО-формолвакцина из лапинизированного вируса Π— 194, изготовленная на фосфатном буфере (контрольная), отличается низкой иммуногенHQстью, средняя ИмДаа трех серий составляет
0,48+-0,07 мл. Лктивность ГОЛ-формолвакцины из лапинизированного вируса Π— 194, изготовленной на растворах Хенкса, Эрла, Ти10
35 реактогенностью и легко месте введения.
Для изготовления ГОЛ-формолвакцины использовали лапинизированный вирус ящура типа О, штамм 194,3 — 10 пассажей, адаптированный к крольчатам двух-трехдневного возраста. Было изготовлено и испытано 15 экспериментальных образцов вакцины из лапинизированного вируса типа О, из которых 12
IIB соленых изотоничсских растворах Хенкса, Эрла, Тиродс, Дульбекко с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина фирмь(«Дифко» (по
3 образца), и 3 серии в качестве контроля на фосфатно-буферном растворе. Лвиарулентность всей серий вакцины контролировали на мышатах-сосунах, иммуноге нность — путем определения 50% иммунизирующих доз (ИмД;О) вакцины для взрослых белых мышей. При этом мышам вакцину вводили в области спины в цельном виде и в разведениях
1: 2, 1: 4, и 1: 8, доза 0,8 мл. Каждой дозой вакцины прививали по 20 мышей, а в качестве контроля оставляли такое же количество нсвакцинированных животных. Через 21 день после вакцинации привитых и контрольных мышей заражали подкожпо в дозе 10000
ЛД50/ìë индикаторным штаммом вируса, адаптированным к этому виду >(сивотных.
Учет результатов проводили в течение 10 дней по количеству выживших мышей к общему числу привитых животных, 50%-ную иммунизирующую дозу вакцины рассчитывали по методу Кербера-Лшмарина.
В результате проведенных опытов установлено, что все серии вакцины были авирулентными и безвредными. Данные контроля иммуногенности вакцины на взрослых белых мышах представлены в табл. 1. роде, Дульбекко с 0,5%-ным гидролизатором лактальбумина повышается от 3 до 4 раз, по сравнению с контрольной. Различие статически достоверное (B<0,01). В то же время не отмечсно существенных различий в активности вакцин, изготовленных на любом из изотонических солевых растворов с гидролизатом лактальбумина.
561732
Таблица 2
Показатели иммуногениости ГОА-QopMoJ!aaRIIHHbI в зависимости от вида гидролизатов
ИмД5, для мышей, мл опыты
М+м
Растворы и гидролизаты
П1
Фосфатный буфер
Хенкс+0,5% ГЛА „Лифко"
Эрла+0,5% ГЛА .Ферак"
Хенкс+0,5% ГЛА „Олайнски11"
Эрла+0 5% ГЛА „Цолипк"
0,29 0,02
0,12 0,02
0,11 0,001
0,13 0,02
0,11 0,01
0,30
0,13
0,13
0,12
0,09
0,24
0,12
0,10
0,14
0,13
0,32
0,12
0,11
0,12
0,11
Таблица 3
Иммуногенность противоя1цурной вакцины типа 0-194, приготовленной на солевом изотоиическом растворе с добавлением гидролизата
Результаты контрольного заражения
Серия вакцины, а!о
КРС, М
Генералнзовакные
ЯIIIVP
Первичные афты
Не заболели
201
203
Контроль
Была испытана иммуногенная активность
12 серий ГОА-формолвакцины из лапинизированного вируса ящура типа 0 — 194, изготовленной на солевых изотонических растворах
Хенкса и Эрла с гидролизатами лактальбумиПолученные результаты на взрослых мышах были подтверждены и в опыте на крупном рогатом скоте. С этой целью па крупном рогатом скоте была испытана иммуногснность двух опытных серий противоящурной ГОАформолвакцины из лапинизированного вируса типа 0 — 194. Серия 201 пригото1влена па растворе Тирода с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина фирмы «Дифко», и серия 202 на растворе Хенкса с 0,5% гидролизатом казеина, производства Олайнского завода.
Иммуногенность вакцины определяли на 6 животных (по 3 головы крупного рогатого скота на серию), которым прспарат вводили
Следовательно, противоящурная ГОА-форM0JI)BBKIIè IB из лапинизированного вируса типа 0 †1, изготовленная на солевом изотоническом растворе Хенкса, Эрла, Тироде или
Дульбекко с добавлением 0,5%-ного гидролизата лактальбумина или казеина является авирулентным, безвредным и иммуногенным препаратом, 6 на «Дифко», «Ферак», казеина «Олайнский» и
«Цолипк». В качестве контроля служили вакцины, изготовленные на фосфатном буфере (3 образца). Результаты контроля иммуно5 генности вакцины представлены в табл. 2. подкожно в области верхней трети шеи в дозе 4 мл. 1-Ia 21 день после прививки крупный
25 рогатый скот заражали гомологичным вирусо» я1цура в дозе 10000 ИДз /0,2 мл в слизистую оболочку языка. В результате испытания Вакцп!Iы IIQ кр1 пном рогатом скоте установлено (таблица 3), что обе серии вакцины
30 обладалп выраженной пммуногенностью. Так, пз 6 привитых животных 4 головы не заболели ящуром, а у двух отмечены первичные афты на месте введения вакцины.
Контрольные животные (2 головы) заболе35 ли ящуром с генерализацией процесса через
48 — 72 ч.
Была показана возможность повышения иммуногенности 12 серий противоящурной
60 ГОА-формолвакцины из лапинизированного вируса типа А» 550 за счет использования солевых изотонпческих растворов с гидролизата ми. 1
Пример. Противоящурну!О ГОА-формол65 вакцину готовили следующим образом: лапиФормула изобретения
Составитель А. Алексеенок
Техред
Релактор Л. новожилова
И; t № 554 Тираж 563 11одписное
:ГС . у..гр —;::.о о и::: ". ò", Совста Министров СССР по лолам пооорстснпй п открытий
113035, Москва, 1К-35, Раушская наб., д. 4/5
"и <а", 1691/6
Типография, пр. Сапунова, 2 низированный вирус производственного штам ма измельчали на мясорубке с последующйМ размолом на размельчителе тканей PT-1 илй
PT-2, а при изготовлении производственных серий на коллоидных мельницах типа IV — 8 и IV — 10 с добавлением соленых изотонических растворов Хенкса, Эрла, Тироде или
Дульбекко с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина или казеина (рН 7,4 — 7,8) в соотношении 1: 10. Затем в суспензию вносили антибиотики (пенициллин и стрептомицин по
200 кд/мл). После экстрагирования;в течение
1 — 2 ч в суспензию добавляли 5 — 10% хлороформа и смесь эмульгировали на размельчителе тканей или коллоидной мельнице с последующим центрифугированием (сепарированием). В очищенную суспензию добавляли мертиолат 1: 20000.
Затем к заранее приготовленной 3 -ной гидроокиси алюминия на солевом растворе
Хенкса добавляли вируссодержащую суспензию и проводили сорбцию вируса (с лериодическим встряхиванием — перемешиванием компонентов) в течение 20 — 30 мин (1 — 2 ч), рН смеси (ГОА-суспензия) составляла 7,4—
7,8; температура 4 — 6 С. По окончании сорбции вируса на гидроокись алюминия температуру смеси доводили до 25 — 26 С и с помощью гликоколового буфера устанавливали р Н, равный 8,6 — 8,8.
По достижении указанной температуры и рН смеси при постоянном помешивании к общему объему добавляли 0,05% пятидесятипроцентного раствора формалина (с поправкой на количество формальдегида) и проводили инактивацию вируса в течение 48 ч.
После инактивации рН препарата с помощью
5N раствора соляной кислоты (х. ч.) устанавливали в пределах 7,6 — 7,8 и охлаждали до температуры 4 — 6 С. При указанной температуре производили отстой инактивированного препарата жидкости в количестве 50% от общего объема. К оставшемуся объему концентрированного препарата добавляли 10% глицерина, 0,5% десятипроцентного раствора сапонина и хинозола. Все компоненты перемешивали в течение 20 — 30 мин и готовую вакцину хранили при температуре 4 — 6 С и рН 7,4 — 7,8, 8
Пропись вакцинь1 на 1110 л следующая, л
10%-ная вируссодержащая суспензия 1400
3%-ная гидроокись алюминия 600
После удаления надосадочной жидкости в количестве 1000 л, к оставшемуся объему
1000 л концентрированного препарата добавляли, л:
Глицерин 100
10% -ный сапонин 5
10%-ный хинозол 5
Вакцина представляет собой однородную жидкость серовато-зеленого цвета, при хранении которой на дне флакона образуется рыхлый осадок, при встряхивании легко разбивается и вновь превращается в однородную,,равномерную взвесь.
1. Способ получения противоящурной ГОАформолвакцины из лапинизированного вируса, включающий культивирование вируса, приготовление вируссодержащей суспензии, 25 ее экстрагирование и эмульгирование, очист«у вируса, добавление гидроокиси алюминия для сорбции вируса и инактивацию его, отл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения иммуногенности и уменьшения ее реактоген30 ности, вируссоде|ржащую суспензию готовят на солевом изотоническом растворе, например Хенкса, Эрла, Тироде или Дульбекко с добавлением 0,5%-ного гидролизата лактальбумина или казеина, 35 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к очищенному вирусу добавляют гидроокись алюминия, предварительно приготовленную на соленом изотоническом растворе
Хенкса.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Патент ФРГ № 1161387, кл. 30 h6, 1969.
45 2. Временная инструкция по изготовлению и контролю противоящурной концентрированной гидроокисьалюминиевой формолвакцины из лапинизированного вируса А, 25.03.71.
3. Тараненко Корректор Л. Брахнина