Способ получения производных аминосахаров

Способ получения производных аминосахаров

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

пп, 562202

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советскнх

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 20.09.74 (2!) 2063266/04 (23) Приоритет — (32) 22.09.73 (31) Р 2347782.9 (33) ФРГ

Опубликовано 15.06.77. Бюллетень № 22

Дата опубликования описания 28.10.77 (51) М. Кл. С 07Н 5/06

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений л открытий (53) УДК 547.963.02 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Вернер Фроммер, Бодо Юнге, Уве Койп, Луц Мюллер, Вальтер Пульс и Дельф Шмидт (ФРГ) Иностранная фирма

«Байер АГ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЪ|Х АМИНОСАХАРОВ

НО ОН Сн

НО Нп

С11 01»

Изобретение относится к способу получения новых производных аминосахаров, которые могут найти применение в качестве лекарственных препаратов и обладают улучшенными свойствами по сравнению с их ближайшими аналогами.

В биоорганической химии известен ферментативный синтез олигосахаридов с использованием трансгликозидазы, где донором служат О-гликозиды любого типа, а акцептором — любое гидроксилсодержащее соединение.

Описывается основанный на известной в биоорганической химии реакции способ получения новых производных аминосахаров общей формулы где Я означает олигосахаридную цепь с п=1 — 7 гексозными единицами, заключающийся в том, что организм семейства актинопланацей в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, соли и в случае необходимости антпвспениватель, выращивают в аэробных условиях прп рН от 5,0 до 8,5 с последующим выделением целевого продукта известными приемами. В случае необходимости проводят мпкробактериальное, ферментативное или химическое разложение пли превращение высших звеньев гомолитического ряда в низшие звенья.

Для проведения предлагаемого способа применяют микроорганизмы принадлежащего к порядку актпномпцетов семейства актинопланацей, в особенности штаммы для актинопланов. Примерами являются штаммы Actinoplanes spec. SE 50 (CBS 961.70), SB 18 (CBS

15 957.70) и SE 82 (CBS 615.71).

Для проведения предлагаемого способа, кроме того, можно использовать мутанты или варианты этих штаммов. Учитывая общий выход предлагаемых производных аминосахаров

20 и/или долю радикала R в смеси образовавшихся при ферментации производных аминосахаров, особенно пригодными оказались штаммы SE 50/13 (CBS 614.71) и SE 50/110 (CBS 674.73). Оба штамма в значительной

25 мере соответствуют описанию родового штамма SE 50. Эти штаммы получают из штамма

SE 50 естественным отбором, не применяя мутагенов.

562202

Для проведения предлагаемого способа применяют твердые и жидкие, в частности жидкие, водные питательные среды, которые наряду с источниками углерода содержат источники азота, соли и антивспениватели в обычных концентрациях. Концентрации могут колебаться в широких пределах.

В качестве источников углерода слу кат преимущественно углеводы, в частности крахмал, мальтоза, глюкоза и смеси из двух (или трех) из этих веществ, а также комплексные смеси, например солодовый экстракт.

В качестве источников азота можно использовать обычно принятые в микробиологии комплексные смеси, например гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, пептон, рыбную муку, растворимые рыбные экстракты, воду от набухшей кукурузы, мясной экстракт и также смеси, кроме того, аминокислоты и/или аммониевые соли.

При проведении предлагаемого способа обычно работают в аэробных условиях в проветриваемых культурах, выращенных при постоянном встряхивании, или в культурах, выращенных в сосудах. Род и концентрация углеродного источника в комбинации с применяемым для ферментации штаммом настолько влияют на род целевого продукта в отношении доли радикала R, что отдельные звенья гомологического ряда или по меньшей мере очень узкую область гомологов можно получать почти селективно. Оказалось, что в питательных средах, содержащих более 2 крахмала, образуются прежде всего производные аминосахаров с 4 — 7 единицами гексозы и что для этой цели особенно пригодным штаммом является SE 50/13 (СВ$614.71).

Однако при известных условиях для получения смесей производных аминосахаров с 4 — 7 единицами глюкозы достаточно к питательным средам, содержащим, например 3,5 глюкозы, в качестве источника основного углерода добавить 0,1 — 3, предпочтительно 0,5 — 2 / крахмала. Кроме того, оказалось, что в питательных средах, не содержащих крахмала, в частности после добавки мальтозы к питательной среде, в частности со штаммом SE 50 (CBS 961.70), преимущественнополучаютпроизводные аминосахаров с 2 — 3 единицами гексозы. Особенно выгодными для получения предлагаемого производного аминосахаров с

R-глюкозой оказались питательные среды, которые как источник углерода содержат только глюкозу. Если питательная среда содержит избыток глюкозы, то при более длительной ферментации образуются также производные аминосахаров с более длинной цепью. Это в. определенных пределах можно предупредить, следя за тем, чтобы при ферментации истощение азотных источников совпадало с моментом истощения глюкозы. Если питательные среды не содержат глюкозы и в качестве углеродного источника служит мальтоза, то преимущественно получают производные аминосахаров с 2 единицами гексозы, причем чи5

65 стую мальтозу можно заменить более дешсвыми смесями, например мальтцином, естественным солодовым экстрактом фирмы «Диамальт АГ», Мюнхен, ФРГ. В зависимости от содержания малтотриозы образуется также следующий высший гомолог. Особенно выгодным для получения низших гомологов оказался штамм SE 50/110, который в оптимальных питательных средах дает примерно вдвое больший выход низших гомологов, чем штамм

SE 50/13.

При ферментациях состав остальной питательной среды, в частности концентрация азотных источников, и состав солей могут колебаться в широких пределах.

Питательные среды стерилизуются обычными способами. Значения рН питательной среды колеблются в пределах от 5,0 до 8,5, предпочтительно от 6,0 до 7,8. Температуры для выращивания составляют 15 — 45 С, предпочтительно 24 — 32 С. Для получения высших гомологов с штаммами SE 50 и SE 50/13 выгоднее работать при более высокой температуре, например при 28 С, для получения низших гомологов с штаммами SE 50 и SE 50/110 при более низкой температуре, например при 24 С.

Период выращивания составляет 1 — 8 дней, предпочтительно 2 — 6 дней. Более длительный период выращивания, в частности при избытке углеводов, благоприятствует образованию высших гомологов. Окончание ферментации определяют ферментативной пробой на наличие замедляющего действия и тонкослойной хроматографией.

Низшие гомологи предлагаемых производных аминосахаров можно также получать из высших гомологов отщеплением единиц гексозы. Отщепление происходит с помощью водных кислот, в частности 1 — 5 нормальных минеральных кислот в течение 10 — 180 мин при температурах от 50 до 100 С, в частности при температурах от 90 до 100 С, или посредством инкубации ферментами (гидролазами), в частности Р-амилазами или неингибируемыми а-амилазами или амилоглюкозидами микробного происхождения, например, а-амилазами из В. subtilis или посредством инкубации микроорганизмами. которые растут в питательных средах, которые предпочтительно как единственный источник углерода содержат высшие гомологи предлагаемых производных аминосахаров в количестве от 1 до 10 /, предпочтительно от 2 до 5 /, как, например, Aspengillus niger (АТСС 11.394).

Выделение и очистку предлагаемых производных аминосахаров осуществляют из микробиологических культурных бульонов или кислых гидролизатов, или инкубационных смесей, в которых проводилось ферментативное и/или микробиологическое разложение высших гомологов производных аминосахаров.

В зависимости от пределов молекулярного веса, к которым относятся выделяемые вещества, необходимы различные методы разделе562202

5 пия. Высшие гомологи выделяют непосредственным оса)кдением после предыдущих обесцвечивания и концентрации растворов.

Низкомолекулярные гомологи получают предпочтительно адсорбцией на активном угле при нейтральном значении рН, при последующей десорбции водными спиртами или ацетоном, предпочтительно 50 — 80О/о-ным ацетоном. Десорбция удастся полностью при кислых значениях рН в пределах от рН 1,5 до 4, предпочтительно от рН 2 до 3.

Если исходные растворы имеют очень темный цвет, их обесцвечивают до адсорбции предлагаемых веществ посредством активного угля при кислых значениях рН (рН 1 — 3) или неспецифическими адсорбционными смолами, например, Lewapol" Са 9221 (размер зерен

0,35 мм) фирмы «Байер АГ», в пределах рН от 2 до 7, предпочтительно от 2 до 3. Активный уголь только в кислой области предпочтительно связывает красители, в то время как

Lewapol ни 1в нейтральной, ни в кислой областях не адсорбирует предлагаемые производные аминосахаров, имеющие ингибиторное действие.

Для отделения ингибиторных производных аминосахаров от неактивных сахаридов и других неактивных соединений используют слабощелочной характер этих компонентов. При подходящих условиях (рН 1 — 8, предпочтительно рН 2 — 4; при слабой ионной силе, соответствующей электропроводности (10 мл сим, предпочтительно (2 мл сим) гомологические производные аминосахаров в Н+-форме связываются сильнокислыми катионитами, например, Dowexa 50 % (фирмы Dow Спегп) cals). Как было установлено заявителем, имеющие замедляющее действие производные аминосахаров особенно хорошо связываются с катиопитами из ацетонового раствора (50—

80О/о-ный ацетон, рН 1 — 5, предпочтительно рН

2 — 4), которые при этих условиях обнару3кивают гораздо большую емкость для веществ.

При условии, что раствор содержит более 50О/О ацетона, удается также довольно хорошая связь с слабокислыми ионитами, например, Amberlite IRC-50 (Н+-форма) .

Для десорбции предлагаемых производных амипосахаров из катионитов применяют водные основания или кислоты, предпочтительно аммиак или соляную кислоту в концентрациях

0,01 — 1 валин/л, Из элюатов получают ингибиторно-активные производные аминосахаров — после нейтрализации элюатов соответствующим слабокислым или основным ионитом или после удаления основания или кислоты вакуумной перегонкой в случае летучих оснований ики кислот — после концентрации раствора лиофилизацией или осаждением органическими растворителями, предпочтительно

10 — 20 объемными частями ацетона.

Кроме того, пизкомолекулярные ингибиторно-активные производные аминосахаров отделяются от инертных сахаридов хроматографией ионитами на основе целлюлозы, предЭ ! о

15 о

Э зо )

3()

65 почтительно фосфоцеллюлозы (фирма «CepI3a», Гсйд(ль()срг). В качестве растворителей применяют буфсры, псрдпочтптсльно фосфатные буферы с слабой иош)î i силой, предпочтительно 2 — 100 м. (1, в iacïlîcTII 5 — 10 мМ, в пределах рН от 2,5 до 8, предпочтительно при рН 5 — 6. Гlредпосылкой для эффективного фракциоппрован!1!! является как 310жно малое содержание солсй 13 прсп(!ритах, подвсргаемых (рра! цпО!!прова!1и!О, 13 То 13(чсx!я к 11 кр !сliT(. Iи почти пс мсша)от.

Для полу !сппя отдсльпых звеньев предполагаемого гомологп)еского ряда пшпбпторноактивны.; пропзводпых амппосахаров в чистом виде предварительно очпщеппыс препараты хроматографпруют па пригодном молскулярпом сите, например Bio-Gel" Р-2 (фирмы

«Бпо-Рад», Мю(!хоп), и тош.ослойной «роматографпей псслсду)от фракции элюата. Фракции, содержащпс чистыe производные a (illllocaxaров, соединяют, повторно хроматографируют и после концентрации лпофплпзпруют или, I(а к б !.I л О о 11» c a I! o «1.1 11 I e, o c a )«g a Io z О р г а н и ч ескпм растворптслсм.

В следую.ц)гх примерах гексозпые единицы представляют собой глюкозш>1е едпппцы.

П р и м ер 1. В I(ci(oòoði!. . примерах в качестве исходной смеси применяют препарат, получасмьш следующим образом, В стеклянный фсрмсптср с 8 л питательного раствора, состоящсго пз 5", ц крахмала, 1,0 /о дрожжевого экстракта, 0,2 () К НР04, нз качалочпой колбы подают трехдневный штамм

SE 50/13 (CBS 614.71) и при тщательном размешиваппп и провстрпвашш ш!кубпруют в течение 3 дней прп 28 С, прп этом получают культурал).пу!О жидкость с 105000 ед. Пнг. а м пл а з ы/мл.

6 л этОЙ с1)срмсптацпОППОЙ жидl Ости пос;Iе

Охлаждения до 20 С подкпсля!От полуконцентрированной НХО, (pII 2,5), добавляют 30 г карборафпппроваппого активного угля, перемешивают в течение 10:!i!l, центрпфугпруют в течение 15 31!III прп 10000 оо/мин и прозрачный светло-желтый остаток после нейтрализации ХНэ сгущают до 500 мл, 500 мл копцентрата в течение 45 мпп смешивают с 200 г амберлпта IRA410 Cl, фильтруют на путче и прибавляют 4, 5 Объсм ы части (около

400 мл) метанола, чтобы осадить основное количество высокомолекуляр)!ых продуктов расщепления крахмаза (вместе с сще наличными остатками активного угля). Центрпфугируют в течение 5 мпн прп 5000 оо/»iiп, 850 мл остатка прп тщательном размешпвапш1 iio каплям добавляют к 4 л сухого спирта. Белый хлопьевидный осадок фильтруют на путче, 3 раза промывают спиртом, 2 раза эфиром и сушат в вакууме прп 50=C. Выход 36 г белого порошка с 10 10 сд. Ппг. амплазы/г.

Пример 2. Для оцспкп целевого продукта ферментацпй и состава препаратов тонкослойной хроматогра(1) пс!! 1 мл фсрмсптацпопных жидкостей плп 1 мг препаратов наносят па спликагельные пленки (фирмы Schlcicher

562202

39 б0

7

Schicll, Dassel, Тур Г 1500) и 2 раза проявляют в системе н-бутанол/этанол/вода = 50: 3: 20.

Для цветного изображения ингибиции сахаразы проявленную и хорошо высушенную пластинку (20 м/20Х20 см) опрыскивают фермснтативным гелем и дают ему отвердеть.

Затем в течение 5 мин при комнатной температуре предварительно инкубируют во влажной камере и затем до насыщения опрыскивают субстратным гелем. После отвердения второго слоя геля пластинку помещают в влажную камеру и инкубируют при 40 С. Ингибиционная окраска (светлые пятна, краснокоричнсвый фон) проявляется через 60—

90 мнн. При оптимальном проявлении цвета прерывают процесс и пластинку с находящимися на ней агаровыми слоями сушат горячим воздухом.

Приготовление гелей.

Ферментатпвный гель — 1,5 r агарозы (Гirldustrie Biologique Francais) суспендируют в 100 мл 0,2 М Na-малеинатного буфера со значением рl-I 6,0 и затем растворяют при кипячснни. Прозрачный агаровый раствор охлаждают до 50 С и при перемешивании добавляют 250 мл тритон Х-100-раствора (2 г тритона Х-100+8 г этанола) и 0,5 мл дианизидинового раствора (20 ivll дианизидина/1 мл ацеTolla). Непосредственно до употребления геля добавляют 1 мл GOD/РОР-реактива (12,5 мг оксидазы глюкозы, степень чистоты I, фирмы «Берингер», Ы заказа 15423 и 2,5 мг нероксидазы, степень чистоты I I, фирмы

«EepI»lrep», М заказа 15302, растворенные в

5 мл малеинатного буфера) и 4 — б единиц сахаразы из тонкого кишечника свиньи. До опрыскивания гель нужно выдерживать при температуре 50 С, так как иначе он при процессе опрыскивания затвердевает в соплах.

Субстратный гель: 0,5 г агарозы суспендируют в 100 мл Na-малеинатного буфера с рН

6„0 и растворяют при кипячении, охлаждают до 50 С, добавляют 100 мл тритона (2 r тритона Х-100+8 г этанола) и добавляют 1 г сахаразы (фирмы «Серва» М 35579). После растворения сахаразы гель готов к применению.

Для цветного изображения ингибиции амилазы проявленную и высушенную ТХ-пластинку опрыскивают амилазным гелем (20 мл/20Х

Х20 см пластинка) и оставляют отвердеть.

После пятиминутной предварительной инкубации при комнатной температуре пластинку, покрытую слоем геля, погружают в 0,5 /о-ный крахмальный раствор (1 г крахмала фирмы

«Мерк» М 1252 в 200 мл 0,2 М глицерофосфатного буфера, 0,01 М СаС1, рН 6,9, растворенных при кипячении) и выдерживают в нем в течение 2 мин при 40 С, перемешивая раствор. "àòåì пластинку хорошо промывают дистиллированной водой и для окрашивания нерасщепленного крахмала погружают в разбавленный J -ра твор (4 мл Jq-раствора на

500 мл Н С; J:-раствор: 2,2 г,4+4,4 r KJ, растворенных в 100 мл Н О). Через 1 мин получают оптимальную окраску.

ЗО

8

Приготовление амилазного геля

1 г агарозы ри 100 С растворяют в 100 мл

0,2 М натрийглицерофосфата/0,01 М СаС1 -буфера со значением рН 6,9, после охлаждения до 50 С добавляют 100 мл тритона X-100 (2 г тритона Х-100+8 г этанола). I-Iепосредствен»о до опрыскивания добавляют 100 мл суспензии амилазных кристаллов (10 мг амилазы из поджелудочной железы свиньи/мл насыщенного NFI4-сульфатного раствора фирмы «Берингер», М 15017).

Пример 3. В колбу Эрленмейера емкостью

1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей из 4О/О крахмала, 2 4о/о глюкозы, 0,9О/о гидролизата казсина и 0,9 /о дрожжевого экстракта, значение рН которой посредством NaOH установлено на 7,6, к которой добавлено 0,4o

C;aCOq и которая стерилизована в течение

30 мин при 121 С, засевают 3 мл предварительного штамма SE 82, выращенного в питательной жидкости из 2 /о крахмала, 1 /о глюкозы, 0,5 /о гидролизата казеина и 1 /о дрожжевого экстракта, значение pll которой посредством МаОН доведено до 7,2, к которой добавлено 0,4 /о СаСОЗ и которая стерилизована в течение 30 мин при 121 С, и инкубируют в течение 5 дней при 28 С на качалке. Получают культуральный раствор с 122 000 ед. инг. амилазы/мл, Для дальнейшей переработки мицелий центрифугированием при 12000 об/мин отделяют от соединенных культуральных жидкостей, 300 мл культурального фильтрата подкисляют полуконцентрированной азотной кислотой до рН 2,5 и в течение 10 мин перемешивают с

2,5 г активированного угля. После отделения угля при 12000 об/мин к раствору, нейтрализованному до значения рН б посредством 10 н.

КОН, добавляют 300 мл метанола, выдерживают в течение короткого времени и при

12000 об/мин удаляют осадок. Остаток по каплям добавляют к 3 л этанола, осадок после непродолжительной выдержки центрифугируют при 12000 об/мин, два раза промывают абсолютным этанолом и один раз эфиром, сушат в вакууме, получают 2,23 г продукта с

7,45 10 ед. инг. амилазы/г, который более чем на 95О/о содержит гомологи производных аминосахаров с п>4.

П р и мер 4. В колбу Эрленмейера емкоcTbIo 1 ol c 120 ivlol питательной жидкости, состоящей из 3,5 /о глюкозы, 2 /о крахмала, 0,5 /о гидролизата казеина, 1,3 /о дрожжевого экстракта, 0,3/о СаСОЗ и 0,3 pKgHPOg, значение рН которой до стерилизации устанавливают на 7,8 и которая стерилизована в течение

30 мин при 121 С, засевают 6 мл предварительной культуры штамма SE 50/110, выращенной в питательной жидкости, состоящей из 3 /О соевой муки, 3 /о глицерина и 0,2 /о

СаСО>, и инкубируют в течение 3 — 4 дней при

24 С на качалке. Получают культуральный раствор, содержащий 153000 ед. инг. амилазы/мл Ф 12200 ед инг. сахаразы/л.

562202

Штамм

Ингибитор амиаазы, ед, з

37000

109000

53500

SE 50

SE 50, 13

SE 50,110

SE 50

SE 50(13

SE 50 110

Пример 9. В ферментер с 100 л питательной жидкости, состоящей нз 3,5о0 глюкозы, 2,5% сухого порошка солодового экстракта, 55 0,5 /о Гпдролпзата казеина, 1,3",о дрожжевОГО экстракта, 0,3о/о CACO,", 0 Зо/о К.НРО; и 0,1 /о антивспеннвателя, засевают 5 л предгярительной культуры по примеру 4 и прн размешиванин и проветривании в течение 5 дней пн60 кубируют при 24 С. Получают культуральпый раствор с 73000 ед. инг. сахаразы/л, который преимкщественно содержит производное ампносахаров с п = 2.

90 л ферментационной жидкости с мпцели65 ем концентрированной азотной кислотой под1 л культурального раствора подкисляют азотной кислотой до рН 2,5, в течение 10 мин перемешивают с 5 г активированного угля и затем в течение 30 мин центрифугируют при

5000 об/мин. Нейтрализуют 25 г амберлита

IRA 410 (ОН вЂ” -форма). Остаток упаривают до

100 мл, добавляют 100 мл метанола и фильтруют. Фильтрат прибавляют к 2 л спирта, выпадающий осадок фильтруют на нутче, три раза промывают ацетоном и эфиром и сушат в вакууме.

Выход 14 r белого порошка с 5.10 ед. инг. амилазы/Г, который преимущественно содержит гомологи с n)4.

Пример 5. Работают аналогично примеру

4, однако с добавкой 0,5о/о крахмала и после четырехдневной ферментации получают культуральный раствор с 40000 ед. инг. амилазы и

184 ед. инг. сахаразы/мл. Культуральный раствор содержит гомологи, начиная с n)1.

Пример б. В колбу Эрленмейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей пз 3 /о глюкозы, 0,6% гидролизата казеина, 1,6 /о дрожжевого экстракта, 0,3 /о

СаСОз, 0,3 /о К2НРО, значение рН которой до стерилизации посредством КОН доведено до

7,8, засевают предварительной культурой штамма SE 50/110 по примеру 4 и инкубируют в течение 4 дней при 24 С на качалке. Получают культуральный раствор с 10 800 ед. инг. сахаразы/л, который преимущественно содержит производное аминосахаров с n= 1.

5 л культура Iüíîãо фильтрата при

1300 об/мин отделяют от мицелия, полуконцентрированной азотной кислотой раствор подкисляют до рН 2,5 и в течение 15 мин размешивают с 55 г активированного угля (фирмы «Мерк») и 200 г СIагсе1 а. После удаления твердых веществ отсасыванием раствор нейтрализуют концентрированным аммиаком до рН 7, упаривают до 1,5 л н осаждают пятикратным количеством этанола. Полученный хлопьевпдный осадок отделяют центрифугированием при 1200 об/мин, желтоватый остаток упаривают до 150 мл и для отделения незначительных нерастворимых частиц центрифугируют с небольшим числом оборотов. 50 мл этого раствора наносят на наполненную амберлптом IR-120. (Н+-форма) колонку (ЗОХ300 мм;

30 мл Н О в час). Собирают 300 мл элюата, содержащего инертные сахариды, а также долю неадсорбированных ингибиторно-активных компонентов, ионит примерно с 400 мл воды вливают в химический стакан и при размешпвании добавляют концентрированный аммиак до рН 11,5. Перемешивают еще в течение

30 мин и отделяют ионит, остаток концентрируют до 1/20 объема, фильтруют через колонку (20X150 мм), наполненную амберлитом

I RA-410 (I-ICO>-форма), и при скорости

30 мл/час собирают 500 мл элюата, который концентрируют и затем лиофилизируют, причем получают 1,3 г сырого продукта.

Для дальнейшей очистки сырой продукт фракционируют с Bio-Gel Р-2 100 — 200 меш (фирмы «Био-Рад», Мюнхен). Для этой цели применяют колонку диаметром 50 мл п длиной 450 мм, которая работает »а воде прп скорости 40 мл/час, причем собирают фрак5 цип по 10 мл. Все фракции посредством антроновой пробы исследуют на наличие углеводов и посредством пробы по замедлен.«о сахарозы на наличие шггибиторно-активных компонентов.

10 Фракции, содержащие ингнбптор сахаразы, кроме того, тонкослойной хроматографией аналогично примеру 2 исследуют на содержание отдельных компонентов. Фракции, содержащие производное ампносахаров п=1, сое15 диняют, концентрируют и лнофнлнзнруют. Получают 35 мг производного аминосахаров с

n=1 с 0,3 10 ед. пнг. амплазы, г и 30000 ед. инг. сахаразы/г.

Пример 7. В колбу Эрлепмейсра с 120 мл

20 питате1ьной жидкости, состоящей пз 5 0 крахмала, 1 /о дрожжевоГО экстракта, 0,2 /о

К НРО4, засевают по 2 мл предварительной культуры по примеру 4. После трехдневной инкубацпи при 28 С получают культуральные

25 растворы со следующим выходом амилазпого ингибитора (преимущественно состоят пз производных аминосахаров с п)4).

Пример 8. В колбу Эрленмейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей из 1,3 /о мальтозы, 3,5 /о Глюкозы, 0,5 о гидролпзата казен <а, 1,3оо дрожжевого экстракта, 0,3 /о СаСО>, 0,3 /о К IIPO,, засе40 вают по 2 мл предварительной культуры по примеру 4. После четырехдневной инкуоацни при 24 С на качалках с различными штаммамп получают растворы со с,1едующимп выходами пнгибиторов (преимущественно состоя из производных ампносахаров с п(4).

Штамм Ингибитор сака- Ингиоитор разы, е1, ма ами 1азы, е1, ма

25 580<

14,8 1460

7 9 755

562202 кисляют до рН 2,5 и добавляют 900 г (l о/о) активированного угля (фирмы «Мерк») для адсорбцпп основного количества образовавшихся красителей. Перемешивают в течение

15 мип, центрифугой при 3000 об/мин отделяют мицслий и основное количество угля и остаток прп дооавке 3 кг Сlагсера фильтруют через путч-фильтр, раоотлющий под давлением. Получают 65 л желто-коричневого, прозрачного фильтрата с 60000 ед. инг. сахаразы/л, фпльтрат концентрированным аммиаком доводят до рН 7 и для адсорбции активного вещества в те тение 30 мин перемешивают с

1300 г (2 " ) активнрованного угля (фирмы

«Мерк»). Фильтруют через путч, работающий под давлением, и осадок лктивировапного угля 3 раза промывают 10 л дистиллированной воды. Затем уголь прессуют досуха и три разя, ка кдый раз в течеттие 15 мин перемешивают с 4 л 50%-ного ацетона при рН 2,5, чтобы десороировать действующее вещество от угля.

После удаления угля фильтрацттей апстоновые элюаты объедиттяют. Объединенный элюат упаривают до 250 мл, добавляют равный объем (250 мл) метанола и фильтпуют через складчатый фильтр. Фи:тьтрат (480 мл) при тщательном paa тстпттвяттип по каплям добавляют к 5 л ацетона. Вычлвшпй осадок фильтруют repea путч и 3 рааа промывают ацетоттом и эсТ)етро . т. 3 лтс iò с" тттлт В EEa E

35 С. Выход 230 " с 8500 ед. ппг. сахаразы/г.

25 r сырого продукта растворяют в 1 л воды и в тс тсттие 30 мпн стспс лстттттвяют с 300 г

Эо л е:Р 50 O 4 II+ (200 — 400 меш). Отфильтровьтвают смол и три плзл промывают 2 л

0,001 и. IICL Пробст.ттт.ттт Dn л сх затем суспендируют B 500 мл вольт, и суспензпю 70бавлением 25о -ного раствора аммиака доводят до рН 9,0. Зятем ещс 2 разя дссорбируют с 500 мл 0,6%-ттого раствора аммт лкл, элюатьт объедиттятот и уплрнвают до 100 м.т. Для обесцвсчивання раствоол eE о в течеттие 5 мин пепеметттивлют с 2 г DAE-ттеллто,тозы (фирмт.т

«ЦТлеттхер тт ТТТюль» % 02035, 0,6 мвалин/г) и затем ттеьттрифугттрутот. Ii светло- т<елтом остатку добавлятот равный объем (100 мл) метяттола и затем ЕЕпЕЕ тщяте.льном перемешивании по каплям добавляют 2 л ацетона. Осадок фильтруют на н .т тс, промывают ацетоном и эфиром и при 35 С сушат в вакууме.

Выход 4,2 г с 26000 ед. инг. сахаразы/г. Для дальнейшей тотткой очистт<и 4,0 г ингибитора по порциям 0,5 г подвергают гель-фильтрации чеоез бттогелт. P-2. Для этой ттели 0.5 г гЕрепярата растворяют в !О м.т Н О тт апосят на колонну с бпогслсм P-2 (200 — 400 меш, сТтттрмы «Био-Рад») диаметром 5 см и длиной

95 см. Проявлятот в воде ЕЕЕЕЕ< степени текучести 80 мл/ч. Собирают 12 тл фракции. У всех фракций опттеделяю осттттсе содергт<ание углеВодов (янтроттовой прооой кяе экстттттт<ция при Есpn), а тат< т<е содер>т<анис ттнгттбиторя сахаразы и амилаaû. Kpoi

ТО

2ст

2д

3О

12

Фракции, в которых находятся производные аминосахаров с n=4 — 6, объединяют, упаривают до 10 мл и осаждают прикапыванием к

200 мл спирта. Осадок удаляют центрифугированием, промывают ацетоном и эфиром и сушат в вакууме; выход из 4,0 г сырого ингибитора: 0,2 г производного аминосахаров с

n=4 — 6 с 17,5 10 ед. инг. амилазы/г и

8500 ед. инг. сахаразы/г. Фракции, содержащие производное аминосахаров с n=3, оорабатывают тем же способом, причем осаждение ведут 200 мл ацетона; выход из 4,0 г сырого ингибитора: 0,1 г производного аминосахаров с n=3 с 1,4 10 ед. инг. амилазы/г и

21 000 ед. инг. сахаразы/г. Из фракций, содержащих производное аминосахаров с n=2 (осаждение ацетоном), выделяют 0,9 r производного аминосахаров с n=2 с 0,3 10 ед. инг. амилазы/г и 68000 ед. инг. сахаразы/г.

Пример 10. В три небольших ферментера, т<аждьтй из которых содер>т<ит 8 л питательной жидкости из 7,5% сухого порошка солодового экстракта, О,ЗО/о гидролизата казеина, 0,7О/о дрож т<евого экстракта, 0,3 /о

СаСО, 0,3 К НРО4, засевают 5 /о предварительной культуры штамма SE 50/110 (получен согласно примеру 4). После пятидневгтой птц<убации при 24 С получают культуральный раствор с 73 ед. инг. сахаразы/мл, который преимущественно содержит производные аминосахаров с n=2.

После центрифугирования (30 мин, 3000 об/мин) для отделения мицелия получают 20,5 л интенсивно-коричневого культурального раствора с 67 000 ед. инг. сахаразы/л.

Добавлением азотной кислоты рН доводят до

3,5 и для ооесцвечивания добавляют 60 r

l ewapol (Са 9221, зернистость 0,35 мм, фирмы «Байер»)/л= 1,23 кг Lewapol После двадцатиминутного перемешивания фильтруют через нутч-фильтр Зейтца К 3. Обесцвеченный культуральный раствор нейтрализуют аммиаком (18,5 л, 67000 ед. инг. сахаразы/л). Затем для адсорбции активного вещества добавляют 20 г активного угля/л=370 г и перемешивают в течение 30 мин, отфильтровывают через фильтр Зейтца К 3, на который был нанесен слой фильтровального вспомогательного вещества Сlагсеl, фильтрат удаляют (17,5 л, 3600 ед. инг. сахаразы/л). Угольный остаток три раза промывают 2 л дистиллированной воды. Для десорбции активного ветцества от угля его последовательно 3 раза по 15 мин промывают 1 л 80О/о-ного ацетона, причем значение рН концентрированной HCI доводят до

2,5. Элюаты ооъединяют (2,4 л 371 000 ед. инг. сахаразы/л). К элюату добавляют 20 г дауэкса (Н+) (дауэкс 50 WX 4, Н+-форма, фирмы

«Серва», Гейдельберг) =46 r дауэкса и перемешивают в течение 20 мин. Затем отфильтровывают смолу (фракттия дауэкса I) и промывают небольшим количеством 75О/о-ного ацетона. Фильтрат и промывную жидкость (3 л=215000 ед. инг. сахаразы/л) смешивают с 60 г амберлита IRA 410 (ОН--форма, фирмы

562202

Выход ед. ингибитора сахаразы, 00

Общее количество ед. ингибитора сахаразы

Ед. инг. сахаразы, л

Выход

Объем, л

Культуральный раствор

После обесцвечивания посредством LewaroI а

После адсорбции активированным углем

Десорбат

То же

20,5

1 373 500

1 306 500

67 000

67 000

19,5

4,8 (удалено) 18,5

66 600

3 600

519 400

296 100 883 500

68 000

890 400

645 000

0,7

0,9

0,8

2,4

3,0

742 000

329 000

85 000

371 000

215 000

37,8

21,6 64,4

5,0

64,8

Смешанный элюат (4 — 6)

После 1-й адсорбции дауэксом

После нейтрализации

IRA ОН

2,8

219 000

27 000

613 200

После 2-й адсорбции дауэксом

Объединенные аммонийные элюаты фракции 1 дауэкса фракции II дауэкса

Осагкденпе фракция 1 фракция II

4,9 (удалено) 67 500

0,29

0,45

197 780

638 550

162 500

442 800

682 000

1 419 000

46 5 L! G0,9

25 000/г

36 000/r

44,0

6,5 г

12,3 г

«Серва», Гейдельберг)/л до установления значения pE I 7. Затем отфильтровывают и к фильтрату (2,8 л, 219000 ед. инг. сахаразы/л добавляют 72 г дауэкса Н+ и перемешивают в течение 20 мин. Посредством висячего пористого найлонового мешочка, наполненного амберлитом IRA 410 ОН вЂ”, значение рН поддерживают на 3,0. Затем отфильтровывают дауэкс (фракция дауэкса II) и удаляют фильтрат (2,6 л, 27000 ед. инг. сахаразы/л).

Каждую из фракций 1 и II дауэкса 3 раза промывают 75 /0-ным ацетоном при рН 3,5 и затем три раза десорбируют 100 мл (фракция 1 дауэкса) или 150 мл (фракция II дауэкса) 0,6 /0-ным раствором аммиака. При первой десорбции, при которой количество аммиака было недостаточным для нейтрализации дауэксной смолы, значение рН доводят до 9

Пример 11. 200 г описанного в примере 1 препарата растворяют в 940 мл дистиллированной воды и в 60 мл конц. серной кислоты и в течение 4 час нагревают до кипения с обратным холодильником (внутренняя температура 98 — 100 С; температура масляной бани

140 С). К охлажденному черно-коричневому раствору добавляют 10 r активного угля (фирмы «Мерк» No 2186) и перемешивают в течение 1 часа. Затем активный уголь отсасывают, промывают водой и фильтрат примерно 250 мл

10 н. К01-1 доводят до рН 7 — 8. Раствор в течение часа перемешивают с 50 r активированного угля. Уголь отсасывают, промывают 2 л воды и фильтрат отделяют. Для десорбции

14 посредством конц. NH3. Трп элюата фракций

1 и II дауэкса объединяют и упаривают досуха, растворяют в 50 мл воды, соляной кислотой доводят до значения рН 3 — 4 и добавляют

5 50 мл метанола. Растворы при перемешиванип по каплям добавляют к 1,5 л абсолютного ацетона, выпавший осадок фильтруют на путче и 3 раза промывают ацетоном и 1 раз эфиром. Сушат в вакууме. Выход: фракция 1

10 65 г, 25000 ед. пнгибитора сахаразы/г. Фракция II 12,3 г, 36000 ед. пнгибитора сахаразы/г.

ФракUHH 1 H 111 i a> ингибиторные,1 .омпоненты преимущественно содержат производ15 ное аминосахаров с п=2 наряду с небольшим количеством следующих высших гомологов (n=8)

В таблице приведены данные о полученных соединениях, 20 уголь в течение ночи дигерируют 2 л 30/0-ного спирта. Затем отсасывают уголь и спиртовой раствор упаривают. Остаток 6,2 г. Сырой продукт (6,2 г) растворяют в 500 мл воды и в течение часа осторожно перемешивают с 30 г амберлита IR 120 (Н+-форма) . Катионпт фильтруют и промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции фильтрата. Затем ионит в течение ночи перемешивают с 15 мл

25%-ного аммиака в 1000 мл воды, отделяют

30 и удаляют. Фильтрат упаривают. Остаток 3,7 г.

Для дальнейшей очистки проводят хроматографию на целлюлозе. 4,5 г десорбированного с ионита материала наносят на наполненную целлюлозой колонку длиной 1 м и

562202

16 шириной 2,5 см. В качестве элюента применяют систему этанол/вода 5: 1, для элюирования производного амипосахаров с п=1 применяют этанол/вода 3: 1. При скорости 20 капель в минуту собирают фракции по 14 мл. Отдельные фракции проверяют тонкослойной хроматографией.

После упаривания фракции 47 — 85 дают

1,6 г коричневатого производного аминосахаров с п=1. Окрашенные примеси количественно не имеют никакого значения. Производное аминосахаров с n= l получают как бесцветную смолу, если очистку проводят с сильнокислым ионитом не периодическим процессом, а на колонке.

Пример 12. 200 г описанного в примере 1 препарата растворяют в 940 мл дистиллированной воды и 60 мл конц. IqSOq и в течение

1/4 часа нагревают до кипения с обратным холодильником (внутренняя температура 98—

100 С; температура масляной бани 140 С). К охлажденному черно-коричневому раствору добавляют 10 г актпвированного угля (фирмы

«Мерк», . % 2186) и перемешивают в течение часа. Затем отсасывают актпвированный уголь, промывают водой и фильтрат 250 мл

10 н. КОН доводят до рН 7 — 8. Растгор в течение часа перемешивают с 50 г активированного угля. Уголь отсасывают, промывают 2 л воды и фильтрат упаривают. Для десорбцпи уголь в течение ночи дигерируют 2 л 30 / -ного спирта. Затем уголь фильтруют, и спиртовой раствор упаривают. Остаток 8,0 г.

Остаток растворяют в 15 мл И О и наносят на наполненную 50 г амберлита IR 120 (Н+-форма) колонку (высота 20 см, диаметр

2,4 см). Подают со скоростью 3 капли в 1 мин и промывают водой (12 капель/мин) до удаления всех основных компонентов. Затем основные продукты 0,5 /в -ным аммиаком удаляют с колонки элюированием (12 капель мин) и водный раствор упаривают досуха. Остаток 4,1 г.

2 г этого остатка растворяют в небольшом количестве воды и наносят на наполненную

Sephadex G-15 колонку (высота 200 см, диаметр 3,0 см). Элюируют водой. При скорости

8 мл/час собирают фракции по 2 мл. Отдельные фракции исследуют тонкослойной хроматографией. Фракции 85 — 94 дают 280 мг производного аминосахаров с n=2 со специфической активностью 50 000 ед. инг. сахаразы/г.

Пример 13. 2 г препарата, описанного в примере 1, в 60 мл 20 мМ натрий-глицерофосфатного буфера с рН 6,9 и 1 мМ СаС1 прп постоянном перемешивании в течение 120 час при 37 С инкубируют 1 г а-амилазы из AspergilIus spec. (фирмы «Серва», Ме 13418), затем в течение 5 мин нагревают до 100 С и нерастворимые части удаляют центрифугированием при 4000 об/мин. После лиофилизации раствора получают 1,9 г продукта с 350 ед. инг. сахаразы/г и 2 10 ед. инг. амилазы/г. Если этот продукт исследуют тонкослойной хроматографией или посредством окраски ингпбиции са1О

2О

4О

65 харазы согласно примеру 2, то оказывается, что в качестве ингибиторно-активных соединений в основном получают производные аминосахаров с n= l, 2 и 3.

Пример 14. Если 2 г препарата, описанного в примере 1, в 30 мл 20 мМ ацетатного буфера с рН 4,8 при постоянном перемешивании в течение 120 час при 37 C инкубируют

1,25 мг р-амилазы из сладкого картофеля (фирмы «Берингер» 15471), затем в течение

5 мин нагревают до 100 С и нерастворимые части удаляют центрифугированием при

4000 об/мин, то после лиофилизации раствора получают 1,5 r продукта с 1800 ед. инг. сахаразы/г и 3,8 106 ед. инг. амилазы/г.

Если этот продукт исследуют тонкослойной хроматографией или посредством окраски ингибиции сахаразы согласно примеру 2, то оказывается, что в качестве ингибиторно-активных соединений в основном получают производные аминосахаров с n=2 и 3.

Пример 15. Если колбу Эрленмейера емкостью 200 мл с 25 мл питательной жидкости, состоящей из 0,1 /в К НРО4, 0,2 (NH4) SO4, О 05о/о MgSO4 О 05о/о КСI О 01 о/о FeSO4 2о/о препарата, описанного в примере 1, засевают суспензией спор штамма Asp. Niger АТСС

11304 и при 28 С инкубируют на качалке, то через б дней снижается титр с 210 000 до

53000 ед. инг. амилазы/мл и через 10 дней до

21 300 ед. инг. амилазы/мл. Одновременно содерхкание ед. инг. сахаразы/мл с 7,0 повышается до 72 ед. ингибитора сахаразы/мл.

20 мл раствора, в течение 10 дней инкубированного суспензией спор, для отделения мицелия в течение 30 мин центрифугируют при

3000 об/мин. Из 15 мл остатка 72000 ед. инг. с