Способ получения алкалоидов спорыньи
Патент 562205
Авторы
Способ получения алкалоидов спорыньи
Иллюстрации
Реферат
1п1 562205
Союэ Советских
Социалистических
Республик
К ПАТЕНТУ (бl) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 20.07.73 (21) 1952210, 13 (23) Приоритет — (32) 21.07.72 (31) R 1 — 470 (33) BHP
Опубликовано 15.06.77. Бюллетень № 22
Дата опубликования описания 28.09.77 (51) М. Кл.- еС 12D 13/00//
А бlК 35/78 тосударствениый комитет
Совета й|ииистров СССР ло делам нэобретеиий и открытий (53) ; К 612.393(088.8) (72) Авторы изобретсния
Иностранцы
Геза Вак, Лайош Надь, Денеш Секель, Иожеф Солноки, Эва Удвардь-Надь и Эржебет Жока (BHP) Иностуаппос предприятие
«Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр РТ» (ВНР) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ СПОРЪ|НЪИ
Изобретение относится к вопросу получения алкалоидов спорыньи ферментативным путем.
Известен способ получения алкалоидов спорыньи, предусматривающий выращивание культуры Claviceps purpurea в аэробных усло ви ях на жидкой питательной среде, в состав которой;входят источники углерода, азота, минеральные соли, и последующее выдсле ние из культуральной жидкости продукта. 10
Получаемые по этому способу алкалоиды спорыньи (пептидного типа) плохо растворимы в водс, а сам ферментативный процесс их получения недостаточно хорошо воспроизводится. 15
Циклическая боковая цспь аклалоидов пептидного типа, состоящая из трех аминокислот, усложняет процесс биосинтсза, Кроме того, .плохо растворимые в воде алкалоиды накапливаются в клетках. Плохая 20 растворимость алкалоидов в воде отрицательно сказывается как на образовании алкалоидов, так и на выделении их пз культуральной среды.
Чтобы повысить эффективность процесса 25 получения алкàлоидов спорыньи, к питательной среде добавляют источники азота, например аспарагин, комплексные источники азота природного происхождения (экстракты дрожжей, пептоны). Однако это приводит к значи- 30 тельному ускорению роста микроорганизмов, а быстрорастущие культуры производят в очень малых количествах такие продукты метаболизма, как алкалоиды спорыньи. Последние образуются во время так называемого вторичного обмена веществ, т. е. когда рост микроорганизмов замедляется. Накопление алкалоидов пептидного типа в клетках микроорганизмов приводит к тому, что часть липидного и пигментного содержимого клеток тоже псрсходит в экстракт. 1Лз целевого продукта их трудно удалить, так как по условиям растворения и распределения эти компоненты близки к алкалопдам спорыньи.
Снижение содержания фосфора в питательной среде до ма",îé концентрации (0,25 r дигидрофосфата калия на 1 л) способствует снижению скорости роста микроорганизмов, однако, это в свою очередь приводит к интенсивному образованию пигмента.
Для повышения выхода препарата по предлагаемому способу получения алкалоидов используют штамм Claviceps рпгрпгеа OKI
88/1972. Этот штамм образует в процессе культивирования на среде с повышенным содержанием фосфора алкалоид пептидного типа, при этом скорость образования алкалоида относительно высока, максимальное количество его накапливается на шестой, седьмой день культивирования.
562205
Таблица 2
Содержание алкалоида на 7-ой день, .,/мл
Концентрация, г/л
1(сточники азота (з,о
Аснар агин
Г1ептон
402
3,0
3,0
3,0
730
Казеин
595
Концентрировавнгяй
25 отвар зерна
11итрат аммония (контроль) 1042
3,0
Таблица 1
Таблица 3
Удельноо содсрж ание алкалоида мг/г
Сухая СодвРжание алкалоида масса/100 мл .,/мл
День культивации
Относительное количество алкалоидов пвптидного типа на седьмой день, о, Содержание алкалоида па седьмой день, -i/.iI" (1итрат аммония, г/л
8,6
8,6
13,0
20,6
31,5
30,4
1
5
0,3
0,7
1,22
1,68
2,18
2,65
2,82
418
834
858
52
66
71
69
61
1072
1482
1121
1036
981
2,0
3,0
6,0
10,0
15,0
Йспользуемый согласно предлагаемому способу штамм культуры Claviceps puIpurea был выделен следующим образом. Исходную культуру Claviceps purpurea культивировали на Sclегоtium с высоким содержанием алкалоида. Были использованы три стадии инокуляции в повторных циклах. B отдельных циклах материал получали на жидкой питательной среде, используя колонии, снятые с твердой питательной среды. После этого, используя полученный инокулянт, готовили жидкую культуру, продуцирующую алкалоид. Клетки, полученные на этой стадии, вновь трансинокулировали на твердую питательную среду.
К каждой порции питательной среды добавляли 1,0 — 10,0 г/л нитрата аммония.
К жирной питательной среде добавляли
0,5 г/л дигидрофосфата калия и 20,0 г/л хлористого. натрия.
Те культуры, которые на шестой или седьмой день культивации продуцировали наиболее подходящее количество алкалоидов пептидного типа, пересевали на твердую питательную среду. В результате выделили штамм
CIaviceps puI purea ОЕЗ 88/1972, который хранится под указанным номером в национальном институте здравоохранения в Будапеште.
Для идентификации этого штамма берут во внимание его следующие морфологические и биохимические признаки.
Морфологические п р из на к и колонии, образовавшейся на питательной среде
SC101 после инкубационного периода в 30 дней, следу;ощне: чсгко ограниченные растущие радиально складчатые колонии диаметром 25 — 30 мм. Бархатисто-белая поверхность со светло-бежевым центром и коричневатой внутренней стороной. С поверхности агара твердые колонии снимаются трудно. Под микроскопом клетки, образующие колонию, выпуклые, хрупкие, зернистые.
После культивации культуры на питательной среде SB 203 ока окрашс <а в свстло-бежевый цвет, напоминает пух.
Под микроскопом клетки культуры образуют сильно преломляюшие, разделенные пере. городками прямые черточки с небольшим количеством ответв IcHHH толщиной 4 — 5 мкм.
По мере старения клетки становятся выпуклыми и зернистыми, Данные по росту штамма н образованию им алкалоида на питательной среде SB 203 приведены в табл. 1.
Влияние оргапических источников азота на ооразование штаммов алкалоида приведено в табл. 2.
Влияние нитрата аммония на образование штаммом алкалоида приведено в табл. 3.
Для того чтобы выделить и идентифицировать алкалоиды, питательный бульон экстраги ровали смесью хлороформа и изопропилового спирта B отношении 4: 1. Экстракт, содержащий алкалоиды, хроматографировали в слое окиси алюминия. Отдельные компоненты вымывали и определяли их концентрацию по УФ-поглощению, используя в каждом
40 опыте идентичные известные стандарты.
Полученные при помощи штамма алкалоиды имеют состав, в o. эргокриптинина 5, эргокорнинина 4, эргокриптина 30, эргокорнина
28, эргозина 5, эргометринина 4, эргометрина
22, другие растворимые в воде алкалоиды 2.
Таким образом, штамм Claviceps рцгригеа
OUI 88,, 1972 является разновидностью, полученной без мутагенной обработки. Он спосо562205 бен продуцировать алкалоиды в условиях сапрофигина. При его содержании в питательной среде 0,01 — 1,0 /О нитрат аммония оказывает не замедляющее, г ускоряющее действие на рост штамма и на образование им алкалоида. В образующих алкалоид питательных средах не наблюдалось образования темнофиолетового пигмента, характерного для штаммов Claviceps. Максимальное количество алкалоида образуется на шестой — седьмой день культивации. На седьмой день культивации количество мицелия было ниже 3,5, а относительное образование алкалоида, рассчитанное на сухие клетки, составляло
30 мг/г; 60 — 70 /О полученных таким об разом алкалоидов состоит из двух компонентов группы эрготоксина и их изомеров соответственно практически в одинаковых соотношениях.
Таким образом, предлагаемый способ относится к ферментативному процессу получения алкалоидов спорыньи, главным образом эргок риптина и эргокорнина, путем культивации указанного штамма на жидкой, подвергнутой аэрации питательной среде, содержащей саха розу, неорганический источник азота и другие известные добавки.
Предлагаемый способ обладает по сравнению с известными многими преимуществами.
Так, он имеет хорошую воспроизводи мость, При удалении органических источников азота из питательной среды и замене их нитратом аммония воспроизводимость может бытьулучшена еще больше, экономичность процесса при этом повышается.
Продолжительность процесса 5 — 6 дней, в то время как продолжительность известных способов 8 — 12 дней.
Ллкалоиды свободно выделяются из питательного бульона.
Образующиеся алкалоиды имеют в питательной среде удачное соотношение: алкалоиды, принадлежащие к группе эрготоксина, образуются в равных количествах, так что при отделении этих двух алкалоидов и при добавлении к полученной смеси эргокриптина эрготоксин может полностью вступать в соединение с обычным соотношением компонентов. Кроме того, при получении алкалоидов спорыньи образуется эргометрин — наиболее важный сопутствующий алкалоид, растворимый в воде. Этот алкалоид легко извлекается в процессе работы и выделяется самостоятельноо.
Приме р 1. Типичную колонию штамма Claviceps ОК1 Ме 88/1972 в возрасте 30 дней снимают с поверхности твердой питательной среды SC 101 и гомогенизируют в 10 мл стерильной воды. 100 мл питательной среды
$2С, помещенные в колбу Эрленмейера на
500 мл, прививаются этой суспензией. Питательная среда S2C имеет следующий состав, г: сахароза 200,0,,лимонная кислота 15,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, гидроокись аммония до рН 5,2, вода до 1000,0.
2д зо
4О
6О
6
Культуру встряхивают при 24 С в течение
6 дней, затем отбирают фракцию 10 мл, которую далее используют для прививки 100 мл питательной среды SB 101, помещенной в колбу Эрленмейера на 500 мл. Питательная среда SB 101 имеет следующий состав, г: сахароза 100,0, янтарная кислота 10,0, нитрат кальция 1,0, нитрат аммония 1,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, хлористый натрий 10,0, ги дроокись аммония до рН
5,2, вода до 1000,0.
Культуру встряхивают при 24 С в течение
7 дней. Содержание сухого материала в культуре составляет 3,42 .
100 мл культуры, полученной как описано выше, экстрагируют 50 мл смеси хлороформа и изопропилового спирта, взятых в соотношении 4: 1. 10 мл экстракта выпаривают, остаток помещают в 1 мл смеси хлороформа и метилового спирта 1: 1 и раствор хроматографируют в слое сухой окиси алюминия.
Пятна алкалоида обнаруживаются в УФсвете; их вымывают 50 "/о-ным раствором метилового спирта в воде, содержащим 1 /о винной кислоты; количество соответствующих алкалоидов определяют по УФ-поглощению.
Полное содержание алкалоида в культуре составляет 1687 у/мл в то время, как содержание из эргокорнпна — эргокриптина до. стигает 1187 у/мл.
Эргокриптин и эргокорнин могут быть выделены в кристаллическом виде из любой культуры известными .методами.
Пример 2. Штамм и твердая питательная среда из агара те же, что в примере 1. Связанный слой мицелия около 150 см . Культуру в возрасте 30 дней извлекают с поверхности твердой питательной среды из агара.
Вещество суспендируют и гомогенизируют в
100 мл воды.
Из полученной таким образом суспензии отбирают фракции по 20 мл и используют их для прививки двух колб Эрленмейера на
750 мл, содержащих по 200 мл питательной среды $С 100. Состав питательной среды SC
100 следующий, г: сахароза 100,0, лимонная кислота 10,0, сульфат магния 0,3, диги дрофосфат калия 0,5, хлористый натрий 10,0, гидроокись аммония до рН 5,2, вода до
1000,0.
Смесь встряхивают при 24 С в течение 6 дней, после чего 400 мл полученного таким образом привитого материала используют для инокуляции 6 л питательного бульона
SB 103, помещенного в лабораторный ферментер на 10 л. Состав питательной среды
SH 103 следующий, г: сахароза 100,0, янтарная кислота 10,0, хлористый натрий 10,0, нитрат аммония 3,0, ниграт кальция 1,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, гидроокись аммония до рН 5,6, вода до
1000,0.
Этот питательный бульон перемешивают при 25 С со скоростью 240 об/мин и насыщают воздухом со скоростью 0,5 л воздуха/л °
562205
Формула изобретения
Составитель М. Андреева
Тсхред 3. Тараненко
Корректор Л. Котова
Редактор Л. Емельянова
Заказ 1691/9 Изд. Л 554 Тираж 563 Подписное
НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Я-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
°,мин. Ферментация продолжается 5 дней.
Содержание сухого материала в полученном таким образом питательном бульоне 3,14%.
Общее содержание алкалоида, определяемое по методике, описанной в пр имере 1, составляет 1046 у/мл. Содержание эргометрина достигает 310 у/мл, содержание эргокорни на— эргокриптина 636 у/мл. Питательный бульон обрабатывают, как описано в приме|ре 1.
Пример 3. Используя штамм, идентифицированный в примере 1, получают слой мицелия на твердой питательной среде SB 010 при инкубации в течение 30 дней. Состав питательной среды SB 010 следующий, г: саха роза 100,0, янтар.ная кислота 10,0, нитрат а ммания 10,0, нитрат кальция 1,0, дигидрофосфат калия 0,25, сульфат магния 0,25, гидроокись аммония (до рН 5,2), волокнистый агар 25,0, вода до 1000,0.
Культуру, выделенную с поверхности агара, и спользуют для приготовления п рививочного материала, как описано в примере 2, с иопользованием питательной среды SC 100.
На 6-ой день культивации порциями по
400 мл полученного инокулята прививают по
6 л стерильной питательной среды SB 101, помещенной в ферме нтер на 10 л, Культивация продолжается в течение 5 дней, как описано. в примере 2. На этой стадии полученные питательные бульоны объединяют, и этот инокулят (18 л) используют для прививки .200 л жид кой питательной среды SC 101, помещенной в ферментер опытной установками на
300 л. Эта среда не содержит волокнистого агара, в остальном она имеет вышеуказанный состав. Питательный бульон перемешивают со скоростью 300 об/мин и насыщают воздухом со скоростью 9 мз/ч.
Ферментация продолжается в течение
6 дней при 25 С. На 55-й и 60-й час ферментации добавляют гидроокись аммония, поддерживая рН культуры 4,5.
На 6-й де нь культивации содержание cyixoro материала в бульоне 3,42 /о, общее содержание алкалоида 1246 у/мл, в то время как содержание эргокорнина — эргокриптина достигает 646 у/мл. Содержание эргометри на
202 //мл.
15 Бульон обрабатывается далее по методике, описанной в примере 1.
20 Способ получения алкалоидов спорыньи путем выращивания культу|ры Claviceps purpurea в аэ робных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники . углерода, азота и минеральные,соли, с последую25 щим выделение м целевого продукта, о тл ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода препарата, используют штамм Clavi.ceps purpurea ОК1 88/1972.
30 Источники информации, принятые во внима ние при экспертизе
1. Патент Великобритании Кв 11117700660000, кл.
С 2G, опублик. 1968.