Способ получения антиген-активного маннанпротеина

Способ получения антиген-активного маннанпротеина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОЫ ЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

<»>562285 (61) Дополнительное к as свид-ву— (22) Заявлено 12.02.75 (21) 2107391j13 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 25.06.77. Бюллетень ¹ 23 (45) Дата опубликования описания 11.08.77 (51) М.Кл.- А 61 К 39/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений (53) У:(К 576.8.097.2 (088.8) и открытий (72) Авторы изобретения

С. И. Бидненко и Д. Е. Дыховичная (71) Заявитель Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и паразитологии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-АКТИВНОГО

МАН НАН ПРОТЕИ НА

Изобретение относится к технологии получения антигенных препаратов, а именно маннанпротеина, используемого в амбулаторной практике для диагностики кандидозов, а также в качестве тест-,п репа рата в научных исследованиях.

Известен способ получения антиген-а ктивного маннапротеина из грибов Candida

albicans, заключающийся в том, что биомассу отделяют от культуральной среды, клетки механически дезинтегрируют, клеточные стенки изолируют дифференцированным центрифугированием, маннан|протеин экстрагируют раствором КОН. Выход целевого продукта составляет 1,1 % от веса сухой биомассы грибов (1).

Известен также способ получения маннанпротеина из дрожжей, включающий механическую дезинтеграцию клеток, отделение клеточных стенок дифференцированным центрифугированием, экстракцию маннанпротеина этилендиамином с последующим выделением целевого продукта с выходом около 1,0% от веса сухой биомассы (2).

Однако эти способы трудоемки и не обеспечивают высокого выхода препарата.

Целью изобретения является повышение выхода препарата и упрощение способа.

Это достигается тем, что экстракцию осуществляют ультразвуком, полученный экстракт лнофнлнзнруют, далее лнофнлнзат растворяют в воде, затем водный раствор лпофилизата фракционнруют на геле декстрана и элюнруют водой. Кроме того, экстракцию

6 ультразвуком проводят при частоте 15—

30 кги„мощности 100 — !50 вт в течение 10—

20 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

Выращенную на сусло-агаре в течение

10 48 час грибную массу Candida albicans смывают с питательной среды, трижды промывают стерильным физиологическим раствором, центрифугируя прн 2000 — 3000 oolxue в течение

30 лин. Затем готовят взвесь отмытых клеток

15 в дистиллированной воде из расчета 30 — 50 лг влажной массы в 1 лл. Взвесь подвергают ультразвуковой обработке в аппарате при частоте 20 кги в течение 15 лин. Можно также обрабатывать клетки прн частоте 800—

20 1000 кги, мощности 5 — 10 8T см B течение

1.5 — 2 час.

Обработка ультразвуком в таком режим" позволяет извлекать локализованный в клеточной стенке маннанпротенн при минимальном разрушении клеток. Бактериологический и микроскопический контроли регистрируют прн этом не более 10 — 12% разрушенных клеток.

Озвученную взвесь центрифугируют при

6,500 — 8000 об!мин в течение 30 мин для уда30 лення клеток и их обломков. Недосадочную

562285 жн",,кость лпофилизируют, при температуре

25 С и остаточном давлении 70 — 80»t»t рт. ст. в течение 144 «ас. Выход полупродукта антигенактивного маннанпротеина составляет 15—

20o/, от веса сухой биомассы. Очистку полупродукта производят гельфильтрацией водного раствора лиофилизата через гель декстрана, например, сефадекса Г-100, при этом максимально сохраняется нативная структура целевого продукта. Элюцию маннанпротеина осуществляют водой. Контроль фракций производят спвктрофотометричеоки при л — 280 я»ь

Первая высокомолекулярная фракция, содержащая целевой продукт, лиофилизируется.

Применение ультразвука в качестве эстра- 15 гнрующего средства в сочетании с лиофплизацпей и последующей гельфильтрацией представляет собой новый законченный технологический способ, приводящий к новому положительному эффекту, а именно полученшо вы- 2О сокоактивного маннанпротеина, содержащего около 90О/о сахар более 60 /о которого представлено маннозой, и 5 — бо/о белка. Благодаря исключению стадии изоляции клеточных стенок из биомассы грибов и предложенному 25 условию выделения маннан протеина способ его получения существенно упрощается, а выход увеличивается в 3 раза и составляет 3 /О от веса сухой биомассы. Полученный лнофилизированный препарат сохраняет антигенную активность при 4 С на протяжении двух лет.

Пример. 1,25 г влажной биомассы грибов С. albicarts, выращенной на сусло-агаре в течение 48 «ас при 37 С, промывают 4 раза

50 лл стерильного физиологического раствора, центрифугируют при 3000 обlмия в течение 30 мия. Затем готовят 25 л л взвеси отмытых клеток в дистиллированной воде пз расчета 50 лг влажной биомассы На 1» л н подвергают смесь ультразвуковой обработке в 4О аппарате MSE-150W Cat КОКС-100 при частоте 20 кгпв в течение 15 мия. Озвучеш|ую взвесь центрифугируют при 7000 об|мия в течение 30 мия. Полученную опалесцирующую недосадочную жидкость в объеме 25 ял, ""..=бс дную по данным микроскопического и ба ктериологического контроля от неразрушенных клеток и их облом ков, лиофилизируют при тем пературе 25 С, остаточном давлении 70—

80 мм рт. ст. в течение 144 «ас. В результате M получено 50 л г полупродукта антиген-а|ктивного препарата с выходом 18О/, от веса воздушно сухой грибной массы. Для дальнейшей очистки полупродукта анпиген-акппвного препарата 50 мг лиофилизата растворяют в 55

0,5 лл дистиллированной воды и полученный раствор фракционируют гельфильтрацией чеpeç колонку с сефадексом Г-100. Высота колонки 55,0 сл, диаметр 1,8 с»ь Маннанпротеин элюируют водой со скоростью 10 — 15»tit!«ac, при этом объем отбираемых для анализа проб составлял 3,5 — 4,0 мл. В каждой пробе измеряют оптическую плотность растворов при

Х вЂ” 280 ял на спектрофотометре СФИ-4А. Полученную при гель-фильтрации первую фракцию лиофилизата в объеме 15 лл, являющуюся раствором маннанпротеи на, сушат лиофилизацией в камере Долинова при указанном режиме и получают 7,5 лг препарата, что составляет 3,1 о/о от веса сухой биомассы. Препарат содержит 92,4o/0 сахара, 70/ которого гредставлено маннозой, и 4,8o/, белка.

Предложенный способ технологически прост, не требует сложной аппаратуры и позволяет повысить выход антиген-активного маннанпротеина в 3 раза .по сравнению с известными способами и получать препарат в количествах, необходимых для диагностики кандидозов в широких масштабах.

Испытания показали, что иммунологнческая активность полученного препарата превосходит активность применяемых для диагностики полисахаридных препаратов, выделен ь х химнческой экстракцией, в реакции связывания комплемента в 8 раз, пассивной гемагглютинации в 2 раза, встречного иммуноэлектрофореза в 2 — 4 раза.

Формула изобретения

1. Способ получения антнген-aKrasaoão маннанпротеина путем выращивания дрожжей или дрожжеподобных грибов на питательной среде, отделения биомассы от культуральной жидкости с последующей экстракцией и выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода препарата и упрощения способа, экстракцию осуществляют ультразвуком, полученный экстракт лпофилизируют, далее лиофилизат раство;яют в воде, затем водный раствор лиофилизата фракционируют на геле декстрана и элюируют водой.

2. Способ по п. 1, отл ичающийся тем, что экстракцию ультразвуком проводят при частоте 15 — 30 кгпв, мощности 100 — !50 вт в течение 1Π— 20 лшя, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.

1. J. В1о1орса1 chemistry, 1959, М 9, 234. р. 2281.

2. 1. Biological chemistry, 1960, 75, р. 12.