Способ получения антибиотиковметаболитов

Способ получения антибиотиковметаболитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПИ

ИЗОБ 1 56392!

Сова Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительн

51) М. Кл. С 12D 9/00 (22) Заявлено 24.0 (23) Приоритет (31) 53283/74 (33)

Опубликовано 30.

Государственный комитет

Совета Министров СССР па делам изобретений и открытий

53) УДК 615.779.9 (088.8) Дата опубликования описания 20.10.77 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Франческо Паренти, Каролина Каронелли, Гиоргио Тамони и

Жаикарло Ланчини (Италия) Иностранная фирма

«Группо Лепетит С.п.А.» (Италия) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВМЕТАБОЛ ИТОВ

Изобретение относится к области микробиологии.

Целью изобретения является получение антибиотиков-метаболитов.

Эта цель достигается тем, что штамм Actinoplanes darbadinensis АТСС 31 049 или Actinoplanes liguriae ATCC 31 048 выращивают в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с,последующей экстрахцией целевого продукта и разделением его на фр акции.

Предлагаемые антибиотики являются новыми и способ их получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Штаммы- продуценты антиоиотика получены из почвенных проб, отобранных в Temossi (Италия), коллекция А (6 353), и в Garbadi

Bridge (Индия), коллекция А (10889). Ооа штамма входят в состав исходной культуры, хранящейся в коллекции АТСС под J¹¹ 31 048 и 31049.

Штамм Actinop lanes liguriae АТСС 31 048 хорошо растет на различных а|гаровых средах.

Атар с овсяной мукой. Колонии диаметром около 5 мм, обнаруживают изрезанные очертания, слабо выраженные бороздки в радиальном направлении и центральную впадину. Во.. душных мицелиев не образует. Arap с овсянои мукой, глицерин-аспарагин-агар, глюкозный агар Чапека. Обильное образование спорангиев разной формы и величины в зависимости от среды. Ha agape с овсяной мукой спорангии имеют правильные очертания, форму от сферической до овальной, величину 15—

25 мкм. Сферические споры подвижны, диаметр 1,5 — 2 мкм. В различных средах образуется янтарно-желтьш растворимый пигмент.

Штамм Actinoplanes garbadinensi» хорошо растет на различных питательных агарах. Поверхность непрозрачна, обычно от,шерохова1Q той до морщинистой. Воздушных мпцелпев нег, за исключением рудиментарных форм на некоторых средах. Вегетативный мицелий слегка разветвлен, диаметр около 1 мкм. Умеренное развитие спорангпев только на агаре с малеатом кальция, форма шаровидная, поверхность неправильная, часто дольчатая, диаметр 7,0—

12,0 мкм. После разрыва спорангиев иногда наблюдается вырывание спор. Подвижные сзторы почтп,шаровпдны, диаметр 1,0 — 1,5 мкм.

20 В табл. 1 приведены культуральные признаки штаммов АТСС 31 048 и 31049 в различных стандартных средах. Признаки определяют после выдержпвания культуры прп

30 С в течение 6 — 14 суток.

25 Температура выращивания колеблется в пределах от 18 до 42 С, предпочтительно 28—

37 С.

Штамм Actinoplanes garbadinensis АТСС

31 049 усваивает фруктозу, рамнозу, маннпт, 30 ксилозу, арабинозу, салпцин, сахарозу, маннозу, лактоз, глюкозу.

Не усваивает инозит, рафпнозу, целлюлозу.

563921

Таблица 1

Культуральные признаки штамма

Среда

31 0 18 / A6353

31 049 А/1С889

Овсяная мука

Тирозиновый агар

Питательный агар

Картофельный агар

Агар Чапека

Яичный агар

Картофель

Дрожжевой экстракт — солодовый агар

Неорганические соли — крахмальный агар

Глицерин — аспарагиновый агар

Пептон-дрожжевой экстракт — железный агар

Агар с овсяной мукой

Агар Хики и Треснера

Глюкозный агар Чапека

Глюкозо-аспарагиновый агар

Агар Беннета

Агар с малеатом кальция

Агар со снятым молоком

Пептон-глюкозный агар

Сыворотка Леффлера

Обильный рост, морщинистая поверхность, янтарная

Умеренный рост, гладкая поверхность, непрозрачная от кремового цвета до оранжевого

Умеренный рост, гладкая поверхность, темно-оранжевого цвета

Умеренный рост, гладкая поверхность, оранжевого цвета

Незначительный рост, шероховатая поверхность, темно-коричневая, коричневый пигмент

Обильный рост, твердая поверхность кофейного цвета, слабо-коричневый пигмент

Обильный рост. твердая поверхность, пигмент оранжевый, рудиментарный воздушный мицелий

Обильный рост, морщинистая поверхность, светло-коричневая

Незначительный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевая, рудиментарный воздушный мицелий

Обильный рост, твердая поверхность, интенсивно-оранжевая

Умеренный рост, твердая поверхность, от оранжевого до светло-коричневого

Обильный рост, морщинистая поверхность, от оранжевого до светлокоричневого, рудиментарный воздушный мицелий

Обильный рост, морщинистая поверхность, светло-оранжевого цвета

Умеренный рост, твердая поверхность, от кремового цвета до оранжевого

Обильный рост, морщинистая поверхность, интенсивно-оранжевая

Незначительный рост, твердая поверхность, светло-оранжевого цвета

Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая

Очень незначительный рост, гладкая поверхность, полупрозрачная

Очень незначительный рост, гладкая поверхность. от светло-оранжевого до янтарного цвета

Очень незначительный рост, морщинистая поверхность, оранжевого цвета

Обильный рост, слегка морщинистая поверхность, светло-оранжевый, светлоянтарного цвета

Обильный рост, гладкая, плоская поверхность, светло-оранжевого цвета, несколько спорангиев светло-желтого цвета; пигмент растворимый

Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая, несколько спорангиев светло-желтого цвета; пигмент растворимый

Обильный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевого цвета; пигмент растворимый, светло-желтый

Умеренный рост, гладкая поверхность, оранжевая

Обильный рост, гладкая поверхность, розово-янтарная, хорошее образование спорангиев, розово-янтарный пигмент

Обильный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевого цвета топаза, хорошее образование больших спорангиев, желтый растворимый пигмент

Обильный рост, гладкая поверхность, розово-янтарная, обильное образование спорангиев

Обильный рост, гладкая тонкая поверхность, оранжевая, обильное образование спорангиев

Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая, несколько спорангиев

Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая

Обильный рост, гладкая.пзв рхнос-ь, янтарного цвета

Обильный рост, твердая поверхность, светло-оранжевого цвета

Очень незначительный рост, гладкая поверхность, бесцветная, несколько спорангиев

Обильный рост, слегка твердая поверхнзсть, интенсивно-оранжевая, желтая, растворимый пигмент

Очень незначительный рост, светлооранжевого цвета, умеренное образование спорангиев

Обильный рост, гладкая поверхность, светло-кремового цвета, умеренное образование спорангиев

Обильный рост, морщинистая поверхность, интенсивно-оранн<евого цвета

Очень незначительный рост, светлооранжевого цвета

Очень незначительный рост, морщинистая поверхность, светло-оранжевого цвета

563921

5

Штамм Actinoplanes liguriae АТСС 31 048 усваивает инозит, фруктозу, рамнозу, ксплозу, арабинозу, мантозу, глюкозу. Не усваивает маннит, рафинозу, целлюлозу, салицин, сахарозу, лактозу.

Штамм Actinoplanes garhadinensis АТСС

31 049 гидролизует крахмал, тирозпн, не гидролизует казеин, малеат кальция. Образовывает HzS, меланин, не коагулирует лакмусовое молоко, нитраты восстанавливает, .разжижает жел атину.

Штамм Actinoplanes liguriae АТСС 31048 гидролизует крахмал, казеи, не гидролизует тирозин, малеат кальция, меланин; Н Б не образует; не коагулирует и не пептонизирует лакмусовое молоко; нитраты не восстанавливает; желатину не разжижает.

Для получения новых антибиотиков штаммы выращивают в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли.

Штаммы обычно подвергают предварительному выращиванию в качалочной колбе до получения значительного количества антибиотиков,;после чего культурой засевают питательную среду в ферментере.

Выращивание продолжают при температуре 25 — 35 С в аэробных условиях до получения значительного количества антибиотиков.

Контроль за концентрацией антибиотиков осуществляют диффузионным методом на агаре с помощью Sarcina lutea в качестве испытуемого микроорганизма.

Полученные антибиотики выделяют из ферментационной жидкости обычными приемами, например экстракцией органическими растворителями, в которых антибиотики нерастворимы и которые не смешиваются с водной средой, такими как Cp — Cp-алканолы и (С1—

С4) -низшие галоидированные углеводороды.

Органическую фазу отделяют от водной среды, концентрируют до небольшото объема и выдерживают 10 — 15 ч:при низких температурах. Выпавший осадок затем отфильтровывают.

Бумажной хроматографией или тонкослойной хроматографией сырого продукта через силикагель и последующим микробиологическим,развитием с помощью Staphylococcus

aureus обнаруживают два активных компонента — метаболиты А и В, причем последний в большем количестве.

Метаболиты А и В отличаются друг от друга величиной Rt, находящейся в зависимости от системы растворителей.

Метаболиты А и В очищают и выделяют обычными приемами, например противоточной экстракцией в системе растворителей, в которой метаболиты имеют разные коэффициенты распределения. Метаболит В получают в виде мононатриевой соли, которая может превра,щаться в другие соли с щелочными или щелочноземельными металлами или в свободную кислоту, обычными приемами.

Метаболпты А, В (гардимицин) и пх соли

:0

61

05 с щелочпыми II щелочноземельными металла. ,ми, а также метаболпт С оказывают хорошее бактерицидное действие ш vt tl o и ш vie о, в частности гардпмицпн оказывает отличное действие in vitro на,tpa»rtoложительные бактерии при концентрации 1 — 50 мкг/мл. Гардимицин действует па изолированные в клинических условиях штаммы Ягер1ососсн..

Кроме того, градимпцпн проявляет сильнос действие lп vtvo на инфекции у мышей, пораженных бактериями родов Diplococcus u Streptococcus. Он имеет очень низкую токсичность:

LDpp BbIIlle 1000 ltr/KI внутрибрюшинно и около 200 мм/кг внутривенно.

Пример 1. Для получения антибиотиков ,штамм Actinoplanes garhadinensi ОТСС

31049 подвергают предварительному выращиванию в аэробных условиях в питательной среде до достижения значительного количества антибиотиков. Культура, выращиваемая на качалке, может быть следующего состава, .г/л:

Мясной экстракт 3,0

Дрожжевой экстракт 10,0

CaCOç 4,0

Крахмал 25,0

Водопроводная ьода До 1000 (мл)

Колбы встряхивают 24 ч при температуре

28 — 30 С, затем предварительными культурами (1 л) засевают ферментеры, содержащие

1.0 л питательной среды следующего состава, г:

Мясной экстракт 40

Пептон 40

Дрожжевой экстракт 10

NaC1 25

Мука из соевых бобов 100

Глюкоза 500

СаСОз 50

Водопроводная вода До 1000 (мл)

Питательные среды засевают в аэробных условиях с,перемешиванием при температуре

28 — 30 С. В определенных интервалах контролируют количество образующихся антибиотиков методом диффузии с помощью Sarcina

lutea в качестве тест-микроба. Максимальное образование антибиотиков достигается через

96 — 120 ч.

Ферментационную жидкость доводят до значения рН 8,0, затем фильтруют с помощью

Hyflo super-cell в качестве вспомогательного фильтрующето средства. Мицелий выбрасывают и фильтрат экстрагируют бутанолом (половиной объема фильтрата). Органическую фазу отделяют от водной, а затем после промывания подкисленной водой (рН 4,0) кон нтрируют до 1/10 объема и выдерживают 10—

12 ч при 3 — б С.

Осадок, полученный на фильтре, промывают бутанолом и высушивают под вакуумом при комнатной температуре. Выход 3,0 г. Хроматографией с помощью бумаги Itntt на сплика геле и последующим проявлением пятен с помощью тест-микроба Staphylococcus aureus обнаруживают два компонента с различными значениями в зависимости от растворителей— р/

563g2I

7, 7,,метаболиты А и В (гардимицин). Сырую смесь подвергают дальнейшей очистке растворениемм в воде (30 мл). Раствор диализируют

16 ч против дистиллированной воды, а затем концентрируют в вакууме до небольшото обьема. Получают еще раз смесь метаболитов Л и В (1,5 r), которые разделяют и очищают несколькими противоточными экстракциями, исходя из различных коэффициентов распределения в определенной системе растворителей 10 бутанол: натрий-калий-фосфатный буфер М/15 (рН 7,2): гексан = 1: 1: 0,1. Коэффициенты распределения составляют 0,3 для метаболита А и 0,8 для гардимицина. После 100 экстракций получают 0,450 .г мононатриевой со- 15 ли гардимицина.

Маточные растворы после экстракции бу I с >4 е и смеси метаболи ов А и

Таблица 2

1 а

1 см

Растворителв макс., к,и

Метано т

273 (плечо)

2gg

26

273 (плечо)

279

288

1Ч,ОН (0,1 и) 2G

О73 (п течо)

279

288

НС1 (0,1 и.) 26

273 (плечо) 79

288 фосфатный буфер (РН 7,38) 24

Подписное

Ко 574 Тираж 563

Сапунова, 2

Типография, пр. тано ом и о а1д н я т

В концентрируют до небольшого объема и выливают в избыток .петролейного эфира. Сразу выпадает осадок, который отфильтровывают.

Хроматографией в вышеуказанных условиях получают продукт со значением R, отличным от значений Я1 метаболитов А и В в тех же растворителях, — метаболит С.

Пример 2. По методике примера 1 выращивают штамм Actinoplanes liguriae АТСС

31 048 в аэробных условиях при температуре

28 — 30 С. Получают 1, 1 r смеси метаболитов А и В (обнаруживается хроматографией), которую очищают и разделяют как описано в примере 1. Получают 0,2 г мононатриевой соли гардимицина, представляющей собой оелы и аморфный .порошок с амфотерным характером. Ее изоэлектрическую точку (4,2) определяют методом электрофокализации. После ,гидролиза в 6 н. НС1 при температуре 120 C в запаянной трубке в течение 16 ч хроматографией обнаруживают следующие аминокислоты: валин, серии, тлицин, глютаминовую кислоту, изолейцин, лейцин и аланин. После щелочного,гидролиза Ва (ОН) 2 при 110 С в запаянной трубке в течение 15 ч хроматографией выявляется и триптофан.

В результате анализа продуктов кислотного гидролиза обнаруживают другие аминокислоты неизвестной структуры, часть которых содержит серу.

Мононатриевая соль гардимицина имеет точку плавления 260 С (разлож.), молекулярный вес 200о — 2168, элементарный состав, С 48,7 — 48,6; Н 6,7 — 6,6; N! 11,8 — 12,2; S 5,3-5,5; Na 1,1; Н О 3,6 — 3,3.

Хроматографические данные гардимнцина .представлены в табл. 2.

ИК-спектр гардимицина. Характерные полосы поглощения в ньюеле наблюдаются .при следующих частотах, см — . 3280,2920 — 2840 (ньюель), 1650, 1520, 1455 (ньюель), 1260, 1045, 990, 720. Удельное вращение; (сс)о = — 44 (с= — 05о/о ДМФ)

Растворимость: растворим в воде, водном

КаНСОа, разбавленных водных растворах щелочных гигдроокисей, горячем метаноле, ДМФ, 11П(1 3акаа 1680 16 11х,.

60 ледяной уксусной кислоте; нерастворим в .разбавленных минеральных кислотах, бензоле ацетоне, хлороформе, СС14, С2 — Са-алифатиче ских алканолах, тетратидрофуране.

Из мононатриевой соли гардимицина мож. но получить следующие производные: свободную кислоту, динатриевую соль, кальциевую соль.

Свободная кислота: 1 г мононатриевой соли гардимицина растворяют в 150 мл воды, добавляют 10%-ный водный раствор НС1, доводя рН до 2,5, а затем два раза экстрагируют

75 мл бутанола, насыщенного водой. Экстракты объединяют и концентрируют при 45 С до

1/20 объема. После выдерживания при 4 С в течение 12 ч выпадает осадок, который промывают петролейным эфиром и высушивают в вакууме при 40 — 45 С. Получают 0,950 " продукта, разлагающегося в пределах от -250 до 300 С.

Динатриевая соль: 1,0 г мононатриевой соли растворяют в 150 мл воды, добавляют 1/10 н.

NaOH, доводя рН раствора до 9,6, затем раствор лиофилизуют. Получают 0,900 г продукта с т. пл. 250 С.

Кальциевая соль: 0,3:г мононатриевой соли растворяют в 20 мл воды, затем к раствору при перемешивании медленно прибавляют несколько порций насыщенного раствора СаС1 до полного осаждения. Осадок фильтруют, вьсушивают в вакууме и растворяют в 10 мл ацетона. После выливания раствора в 200 мл эфира выпадает осадок, который фильтруют и высушивают в вакууме при 40 — 45 С. Получают 0,2;г продукта, разлагающегося при 330—

340 С.

Формула изобретения

Способ .получения антибиотиков-метаболитов, отличающийся тем, что штамм Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049 или Лсtinoplanes liguriae АТСС 31 048 выращивают в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующей экстракцией целевого продукта и разделением его на фракции.