Способ получения 5-фосфодиэстеразы

Способ получения 5-фосфодиэстеразы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е п11566589

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 29.12.75 (21) 2304690, 13 с присоединением заявки ¹â€” (51) М. Кл в А 61К 35J68

ГосУдаРственнмв комитет (23) Приори гет

Совета Министров СССР оо делам изобретений н открытий

Опубликовано 30.07.77. Бюллетень № 28

Дата опубликования описания 22.08.77 (53) УДК 615.779.94 (088.8) (72) Авторы изобретения

Г. Д. Бердышев, Н. В. Югай и H. А. Луценко

ВД1 Я, 1

Киевский ордена Ленина государственный университе qj-" .;-,, . -"стаду им. T. Г. Шевченко аьчфю, (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5 -ФОСФОДИЭСТЕРАЗЪ|

Изобретение относится к получению биологически активных веществ, которые могут найти применение в медицине в качестве лечебных препаратов.

Известен способ получения рибомононуклеотидов из нуклеиновых кислот путем гидролиза РНК 5 -фосфодиэстеразой, полученной из экстрактов растений с последующим выделением целевого продукта ионообменной хроматографией.

Известен также способ получения 5 -фосфодиэстеразы путем экстракции растительного сырья в присутствии органического растворителя при рН 8.

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода фермента.

С целью повышения выхода фермента обработке подвергают гомогенаты тканей моллюсков вида Dreissena или Anodonta и целевой продукт осаждают высаливанием при рН 3 с доведением рН до 5.

Пример 1. Получение ферментного препарата из моллюсков Dreissena polymorpha Pallas.

Берут живых дрейссен и тщательно механически их измельчают. Из измельченной массы берут навеску в 500 г, добавляют 400 мл воды, подщелоченной Na0H до рН 8 (конечная рН гомогената равна 8). Полученную смесь выдерживают на холоде в течение 3 час, далее фильтруют. Осадок, содержащий балластные оелки отбрасывают, а фильтрат подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 3 и оставляют на холоде на 3 дня. Надосадочную жидкость удаляют декантированием, а осадок, содержащий активный фермент, растворяют в небольшом количестве воды (100 мл), рН которой равна 5 (подкисляют соляной кислотой). В процессе выделения 5 фосфодиэстеразы из моллюсков его активность проверяют по расщеплению дрожжевой рибонуклеиновой кислоты. 3а единицу активности фермента принимают такое его количество, которое освобождает в процессе инкубации в данных условиях 1 мкг нуклеотидного фосфора. Инкубационная смесь для гидролиза дрожжевой РНК содержит 0,5 мл натрийацетатного буфера рН 5, 0,2 мл раствора РНК (из расчета 0,5 мг на пробу) и 0,3 мл тканево2р го экстракта (из расчета 1,5 мг на пробу). Инкубацию проводят при 37 С на водяной бане в течение 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 0,01 М imgClg в 80 этаноле (где конечная концентрация 0,01 М MgC1> в 50

25 этаноле) .

Данные, характеризующие ход выделения ,5 -фосфодиэстеразы из моллюсков Dreissena

polymorpha Pallas, представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, выход составляет

30 60%-ный белок, полученный в результате очи566589

3 4

Таблица 1

Выделение препарата, обладающего 5 -фосфодиэстеразной активностью, из моллюсков Dreissena ро .ymorpha Pailas

Еонцентрацця белка, мг/мл

Общая активность

Удельная Выход ферактивность мента, у, Этапы выделения

Гомогенат

0,5

3,04

15,0

14,5

1,5

1,5

56000

61,3

Фильтрат после подщелачивания

Осадок после подкисления

Таблица 2

Выделение препарата, обладающего 5 -фосфодиэстеразной активностью, из моллюсков Anodonta sygnea

Выход фермента, у, Концентрация белка, мг/мл

Общая активность

Удельная активность

Этапы выделения

0,5

4,46

11,05

52500

14,5

1,5

1,9

Гомогенат

Фильтрат после подщелачивания

Осадок после подкисления

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Техред М. Семенов

Корректор Л. 6рахнина

Редактор М. Дмитриева

Заказ 1886/10 Изд. Ме 647 Тираж 693 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 стки, обладающий достаточно высокой удельной активностью.

Пример 2. Получение ферментного препарата 5 -фосфодиэстеразы из анодонты (Anodonta Sygnea).

Вскрывают раковины и отделяют тело моллюска от них. 500 r биомассы гомогенизируют (на 500 г биомассы расходуют 4 л воды, подщелоченной в 1 н. МаОН рН 8. Полученную смесь выдерживают на холоде в течение 3 час.

Затем фильтруют, осадок, содержащий балластные белки, отбрасывают, а фильтрат подПредлагаемый способ получения 5 -фосфодиэстераз из моллюсков характеризуется простотой выделения целевого продукта, дешевизной, а сами 5 -фосфодиэстеразы обладают более высокой ферментативной активностью.

Полученный препарат 5 -фосфодиэстеразы позволяет получать рибомононуклеотиды высокого качества. Себестоимость получения 5 фосфодиэстераз предлагаемым способом понижается на 15 — 25 /о, кисляют до рН 3 концентрированной соляной кислотой и оставляют на холоде на 3 дня. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок растворяют в 200 мл воды, рН которой равна 5.

5 Полученный препарат используют как источник 5 -фосфодиэстеразной активности.

Данные, характеризующие ход выделения препарата 5 -фосфодиэстеразы из моллюсков

Anodonta Sygnea, представлены в табл. 2. Вы10 ход целевого продукта из моллюсков составляет 50%.

15 Способ получения 5 -фосфодиэстеразы путем обработки исходного сырья с последую.щим выделением целевого продукта, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, обработке подвергают гомогена20 ты тканей моллюсков вида Dreissena или

Anodonta и целевой продукт осаждают высаливанием при рН 3 с доведением рН до 5.