Штамм вв -1-продуцент гидрогеназы

Штамм вв -1-продуцент гидрогеназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е (и) 566879

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

/ (51) M. Кл з С 12К 1/00

С 12D 13/10 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 25.03.76 (21) 2337936/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 30.07.77. Бюллетень № 28

Дата опубликования описания 22.08.77

Гос|аарственный комитет

Совета. Министров СССР но дедам; .изобретений и открытий (53) УДК 576.8(088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявители

Е. Н. Кондратьева, Л. В. Богоров, И. Н. Гоготов и Н. А. Зорин

Московский государственный ордена Ленина и ордена Трудового

Красного Знамени университет им. М. В. Ломоносова и Институт фотосинтеза АН СССР (54) ШТАММ THIOCAPSA ROSEOPERSICINA

BBS-1 — ПРОДУЦЕНТ ГИДРОГЕНАЗЫ

20

Изобретение относится к технической микробиологии и микробиологическому синтезу, представляет собой новый штамм серобактерий — продуцент гидрогеназы, и который может быть использован для получения гидрогеназы, обладающей высокой стабильностью в отношении кислорода и температуры, с целью разработки биохимических топливных элементов и фотосинтетических реакторов для получения водорода.

Известен штамм маслянокислых бактерий

Clostridium pasteurianum %з, являющийся продуцентом гидрогеназы (1).

Однако полученный с помощью этого штамма препарат гидрогеназы обладает низкой устойчивостью в отношении кислорода (Оз) и температуры. Полная инактивация фермента наблюдается при хранении препарата на воздухе через 50 — 60 мин н при температурах выше 25 — 30 С.

Предлагаемый штамм Thiocapsa roseopersicina BBS-1 выделен из белого моря и представляет собой культуру серобактерий.

Идентификацию предлагаемого штамма проводили согласно последнему изданию определителя Берги (Bergey s Manual of Determinative Bacteriology, 1974, VIII th. Ed. The

Williams Wilkins Сотпрапу, Baltimore).

Предлагаемый штамм обладает следующими признака ми.

Морфологические признаки.

Чистая культура бактерий при росте в жидкой среде имеет розовый цвет. Thiocapsa

roseopersicina можно выращивать на простой

5 и дешевой среде, используя энергию солнечного света. Для выращивания используют модифицированную среду Пфеннига следующего состава, г/л:

NH4Cl 1,0

КН2РО4 1,0

NaHCO3 2,0

MgC1 1,0

КС1 1,0

NagS 9НзО 1,0

NaC1 10,0

1 1 а2 2Оз 2,0

CaC12 0,1 микроэлементы 1 мг/л; витамин В з 20 мкг/л

Микроэлементы, мг/л:

ZnS04 ° 7Н О 100

МпС1> 4Н20 30

НзВОз 300

СоС1з 6НзО 200

CuClg 2Н20 10

25 NiClg 6НзО 20

Na2Mo04 2НзО 30

РеС1з 200

Выход биомассы составляет 3 г/л (по сы30 рому весу на 5-ые сутки роста), выход фер566879

3 мента — 6,6 /о (по содержанию белка в исходном экстракте).

Клетки культуры Thiocapsa roseopersicina сферические, 1,0 — 1,5 мкм в диаметре. Размножаются бинарным делением, окружены тонкой капсулой, по Граму красятся отрицательно, жгутиков не имеют. Бактерии могут содержать гранулы полифосфатов, поли+оксимасляной кислоты и полисахаридов. При росте на среде с сульфидом или тиосульфатом в клетках откладывается элементарная сера. Фотосинтетический аппарат представлен мембранами везикулярного типа. Содержание ГЦ в ДНК составляет 663—

66,9 мол . Образует бактериохлорофилл А и каротиноиды.

Биохимические признаки.

Бактерии обладают каталазной и гидрогеназной активностями, а также способностью к азотфиксации. Наибольшая скорость поглощения Н наблюдается в присутствии метилвиологена, а выделения Н вЂ” при наличии пирувата или восстановленного метилвиологена, Бактерии не обладают способностью к ассимиляционной сульфатредукции. Рост культур возможен только при наличии в среде $о, S —, S Оз —. Лучшим источником азота является

NH4Cl. Выдерживают концентрацию NaCI до

15 /о, NagS — до 0,15 /о., NagSg03 — до 5 /о. Оптимальная концентрация NazS203 составляет

0 2о/о

Отношение к источнику углерода.

При росте на среде Пфеннига урожай бактерий увеличивается при добавлении к среде с бикарбонатом и сульфидом или тиосульфатом 0,1 /о органических соединений: ацетата, пирувата, лактата, глицерина или глюкозы.

Пример. Получение гидрогеназы при культивировании Thiocapsa roseopersicina 6-ти суточной культуры, выросшей на среде Пфеннига с 0,1 /о NH4C1, 0,1 /о NagSgOg и 0,2/о ацетата в 10-ти литровом ферментере на свету (20.10 эрг/см сек) при 30 С и рН 7,0 — 7,5, клетки осаждают центрифугированием. Полученные клетки (150 г по сырому весу) ресуспендируют в насыщенный аргоном 0,02 М фосфатный буфер рН 7,3 (1:2). Клетки разрушают при помощи ультразвука. Неразрушенные клетки и их частицы удаляют центрифугированием, а полученный исходный экстракт подвергают дальнейшей очистке, включающей следующие стадии: нагревание (75 С в течение 16 мин), фракционирование (NH4) qSO4 (30 — 60 насыщения); гельфильтрацию через сефадекс G-100 и препаративный электрофорез в полиакриламидном геле. В результате применения на конечной стадии очистки гидрогеназы препаративного электрофореза получается электрофоретически гомогенный препарат фермента с высокой удельной активностью (77,3 мкл Н /мин. мг белка) и обладающий высокой устойчивостью к О и температуре.

Активность фермента определяют следующим образом. К 1,5 мл 0,05 М K, Na-фосфат10

Зо

55 б0 б5

4 ного буфера (рН 6,5) добавляют 1 мкмоль/мл метилвиологена. После замены газовой фазы на аргон к реакционной смеси в сосудик добавляют 20 мг/мл дитионита и 0,05 мг/мл фермента. Образование Н измеряют при

30 С из восстановленного дитионитом метилвиологена методом газовой хроматографии.

Формула изобретения

Штамм Thiocapsa roseopersicina BBS-1— продуцент гидрогеназы, хранится в коллекции музея чистых культур кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета под

PJo

Морфологические признаки.

Клетки сферические 1,0 — 1,5 мкм в диаметре, окружены тонкой капсулой, жгутиков не имеют. Клетки размножаются бинарным делением, по Граму красятся отрицательно.

Бактерии могут содержать гранулы полифосфатов, поли-P-оксимасляной кислоты и полисахаридов. При росте на среде с сульфидом или тиосульфатом в клетках откладывается элементарная сера.

Колонии слизистые, диаметром меньше 1—

2 мм, дисковидные, розового цвета с ровным краем.

Биохимические признаки.

Штамм обладает высокой гидрогеназной активностью, измеряемой по поглощению и выделению Н . Гидрогеназа характеризуется высокой термостабильностью (температурный оптимум 75 — 80 С) и устойчивостью к кислороду с периодом полуинактивацин около 6 суток.

Культура не обладает способностью к ассимиляционной сульфатредукции.

Отношение к углеводам и спиртам.

Из сахаров усваивает глюкозу, из спиртов — глицерин.

Отношение к кислотам.

Усваивает уксусную, молочную, пировиноградную, пропионовую. Слабо усваивает а-кетоглутаровую, яблочную, янтарную.

Отношение к источникам азота.

Усваивает соли аммония — NH4Cl, (NH4) gSO4, пептон, гидролизат казеина, аргинин.

Возможен медленный рост культуры за счет использования нитратов. Нитриты не усваивает. Культура способна к .фиксации молекулярного азота.

Желатин не разжижает. Молоко не пептон изирует.

Антагонистические свойства.

В отношении других бактерий и грибов не проявляет.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Nakos G., Mortenson К., Purification and

properties of hydrogenase, iron sulfur protein, from Clostridium pasteurianum %о, «Biochemical Biophysical Acta», 1971, 277, 3, 576—

583.