Штамм -продуцент лимонной кислоты

Штамм -продуцент лимонной кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

<»1568677

Социалистических

Республик (б1) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 04.05.75 (21) 2131235 13 с присоединением заявки Xo— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 15.08.77. Бюллетень ч" 30 (45) Дата опубликования описания 08.12.77 (51) М Кч С 12 К 1/02

С 12 D 1/04

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 663.13!.576:

:661.734 (088 8) (72) Авторы изобретен|ия А. А. Румба, Р. Я. Карклииьш, В. К. Азаида, B. Я. Берзиия, A. А. Лурииьш и В. Ф. Федосеев

Зксперимеитальиый завод биохимических препаратов

AH Латвийской ССР (71) Заявитель (54) ШТАММ ASPERGILLUS NIGER

Р-1 — ПРОДУЦЕНТ ЛHMOHНОЙ КИСЛОТЫ

1 2

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма гри ба, используемого при производстве лимонной кислоты поверхностным методом культивирования.

Известен штамм гриба Aspergillus niger

288, используемый при производстве ли монной кислоты, выход лимонной кислоты .при культивировании ее поверхностным, методом увеличивается на 12 — 25 i .

Известен также штам,м плесневого гриба

Aspergil!us niger М 288/9, который актив но сбраживает мелассу и синтетические среды при поверхностном и глубинном способе культивирования, при этом выход лимонной кислоты по сравнению с выешуказанным штаммом значите l6)HO увеличивается.

Из известных штаммов наиболее близким к предлагаемому .по морфологическим и культуральным признакам является штамм Aspergillus niger ЭУ-.119, который и является исходной культурой при селекции штамма P-l.

Предла гаемый .штамм Aspergillus niger Р-1 отличается от ЭУ-119 |более высокой активностью образования лимонной кислоты из мелассы и значительно более высокой устойчствостью к микроорга низмаи, и нфици рующим бродильные среды. Штамм P-1 хорошо пересбраживает мелассы пониженного качества и его мицелий более вынослив к неблагоп1тиятным условия м ферментацип. Кроме того, даоеный штамм увеличивает выход лимонной кислоты с единицы площади брожения на

14,8 /0, а на меласаных средах образует в

5 среднем 97,8 !0 лимонной кислоты от суммы всех органических кислот в ферментационных Ipастворàx.

Штамм Aspergillus niger P-1 получен путем комбинированного воздействия ультра10 фиолетовых лучей, этиленимина и N-нитрозометнлмочевины на исходный штамм ЭУ-119.

Морфологические свойства штамма P-1 изучались у культуры, выращенной при 35 С на среде Чапека-Докса и сусло-агаре. Куль15 туральные свойства штамма и характер ро"та изучались на питательных средах, применяемых для культивирования Aspergillus niger (среда Чапека-Докса, сусло-агар и ферментацио няая среда, употребляемая для получения лимонной кислоты).

Полученный штамм гриба Aspergillus niger

P-1 имеет следующую характеристику.

Морфологические признаки. Среда Чапека-Докса. Форма конидий 5 — 7-суточной культуры круглая, в диаметре 7 мкм. Конидиальные головки кругловатой формы диаметром в среднем 205 — 215 мкм. Везикулы слегка вытянутой форлы диаметром в сред.":ем

27 мкм. Стерипмы однослойные, длина 10 мкм.

5686?7

Таблица 1

ЭУ-! 19 P-1!

Диаметр, лкя (:.

105 — 115 205 — 215

34 — 35; 27 — 30

Конидиалвиая головка

Везикула (пузырек)

Стеригмы:

I порядка

II порядка

7,5

Нет

Конидии

Конидиеносцы

3,4 7

13,5 20

П р и м е ч а н и е. Длина конидиеносцев штамма ЭУ-119 0,7 — 5, P-1 3 — 4 лы.

Культуральные признаки. Среда ЧапекаДокса. Гигантская колония, выращенная в чашке Петри при 32 С, на пятые сутки имеет круглую форму диаметром 45 — 50 мм. Край 10 колоний ровный, аспорогенная зона — 6 мм.

Субстратный мицелий радиально складчатый. Спороношение тоже радиальное (под влиянием складчатого мицелия), скудное, тамно-коричневое, с пушистым воздушным 15 мицелием.

Среда сусло-агар. Пятисуточная гиган гская колония, круглая. Диаметр колонии

90 мм. Центр колонии с редким возвышенным спораношением, затем следует пояс с густым, 20 низким спороношением, которое в направлении края становится редким.

Ферментационная среда. На ферментационной среде, употребляемой для получения лимонной кислоты, 24-часовой мицелий тониий, складчатый, коричневатый. В ходе цикла мицелий становится беловатым, более плотным и складчатым. Основание мицелия становится буроватым. Мицелий эластичный, коТаблица 2

Съем в 1 сут, г/лР (%) Содержание лимонной кислоты от суммы кислот, %

Выход лимонной кислоты от сахара, % Количество серий опытов

Штамм сумма кислот

1 лимонная кислота

1946

ЭУ-119

1829 (100) 93,9

88,7

2147 2100 (114,8) 97,8

100,0

30 30 — 32 С в течение 9 сут. в кюветах площадью

10 — 12 дм . Зрелые конидии отделяют от мицелия при помощи вакуумного успройсвва. Вы-. ход опор (конидий) с 1 дм2 площади среды

Длина конидиеносцев 3 — 4 мм, диаметр сечения конидиеносцез 20 мкм.

Органическая среда. Сусло-агар. У пятисуточной культуры форма кенидий круглая, .в диаметре 6 мкм. Конидиальные головки в среднем 125 — 145 мкм. Везнкулы круглые, в

Пример. Посевной материал (конидии) шта,мма Aspergillus niger Р-1 получают при посеве чистой культуры, штамма на сусло-агаровой среде. Культивирование производят при среднем 2? — 29 мкм. Конидиеносцы длиной выше 4 мм. Диаметр сечения 15 мкм.

По морфологическим признака,м штамм P-1 отличается от исходного штамма ЭУ-119, что видно -цз приведенного в табл. 1. индий не образует или образует очень мало.

Антагонистические свойства. Штамм P-l, обладает более высокой устойчивостью к бактериям-антагонистам, чем ЭУ-119, и подавляет развитие газообразующих, кислотообразующих и денитрифицирующих (нитрнтообразующих),бактерий (Bact. coli, Leuconostock mesentericides; Pseudomonas (Ps) fluorescens), встречающихся в ферментационном !процессе лимонной кислоты.

Биохимические признаки. Хорошо сбраживает мелас сные и синтетические среды при поверхностном способе культиви рова ния, выход лимон ной кислоты от сахара мелаасы дости гает 99 — 100%.

Кроме того, съем лимонной кислоты с единицы площади мицелия увеличивается в среднем на 14,8% и на мелассных средах штамм образует,в среднем 97,8% лимовной кислоты от суммы кислот.

Полученные результаты приведены в табл. 2.

l,l

Мела сса

Ферроцианид калия

Фосфорноьислый калий однозамещенный

Сернокислый цинк .рН среды

0,16

0,005

6,8-7,0

Составитель М. Ларина

Техред М. Семенов

Редактор Е. Хорина

1(орректор И. Симкина

Заказ 672/1959 Изд ¹ 682 Тираж 563 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент>

1,0 — 1,1 г. Собранные конидии смешивают со стерильным активированным углем в соотношении 1: 2. Такой посевной материал используется для микробиологического получения лимонной .кислоты. Для роста мицелия и образования кислоты готовят ферментационную среду следующего состава, г/л:,Мелассный раствор, нагревают до 100 С и добавляют расчетное количество ферроцианида калия. П ростерилизованный раствор охлаждают до 45 С и добавляют фосфорнокислый калий и сернокислый цинк. Приготовленный раствор наливают в бродильные кюветы высотой слоя 12 см и вводят споры штамма

P-1 из расчета 100 мг/м площади кювета.

В стадии роста и .развития мицелия (в течение 24 — 36 ч) температура культиви1рова ния должна быть 34 — Зб С и аэрация воздуха 3—

4 мз в 1 ч на 1 м мицелия. После;полного образования мицелия в период активного кислотообразования температура культиви рования должна быть 31 — 33 С и аэрация воздуха 15 — 18 мз в 1 ч на 1 м мицелия. Испарение в продолжение пол1ного цикла ферментации составляет 45 — 50% от начального объема раствора. При таком режиме через 9 сут кислотность раствора достигает 180 — 210 г/л, остается несброженным 0,5 — 0,7% сахара. В сброженном растворе содержится 97 — 98% лимон ной кислоты и 2 — 3% глюконовой, щавелевой, яблочной, сахарной, фумаровой, янтарной, малоновой, адипиновой кислот. В течение всего цикла ферментации непрерывно происходит нараста ние биомассы гриба, которая,в конце цикла достигает 1,8 — 2,4 кг/м в пересчете!HB сухой вес.

Ф ор м ул а из об ретения

Штамм Aspergillus niger P-1 — продуцент лимонной кислоты. Хранится в коллекции экспериментального завода биохимических препаратов .института микробиологии и|м. А. Кирхенштейна, г. Рига.

5 Морфологические признаки. У пятисуточной культуры на среде Ча пека-Докса конидиальные головки имеют круглую форму диаметром 205 — 215 мкм. Пузырьки (везикулы) вытянутой формы диаметром 27 мкл. Стеригмы

10 однослойные, длина стеригм 10 мки. Конидии круглые,,их средний диаметр 7 ик,и. Длина конидиеносцев 3 — 4 ил, диаметр 20 л1кл.

Культуральные признаки. Среда Чапека-Докса. Пятисуточная гига1нтская колония, круглой формы, диаметром 45 — 50 л1.и. Край колонии ровный, аспорогенная зона — 6 мм.

Су1бстратный мицелий радиально складчатый. Спороношение скудное, темно-коричневое, с пушистым воздушным мицелпем.

Среда сусло-агар. Пятисуточная гигантская колония диаметром 90 лtë. Центр колонии с редким возвышенным спороношением, затем следует пояс с густым, низким спороношением, который по направлению к краю становится редким.

Ферментационная среда. 24-часовой мицелий тонкий, складчатый, коричневого цвета.

В ходе цикла — после 3 сут 1мицелий становится беловатым, более плотным и складчатым. Основание мицелия становится буроватым. Мицелий эластичный, конидий не образует или образует очень мало.

Антагонистические свойства. Обладает высокой устойчивостью к бактериям-антагонистам.

35 Подавляет развитие газообразующих, кислотообразую|щ»х и денитрифицирующих (нитритообразующих) бактерий (Bact. coli, Leuconostock mesentericides, Pseudomonas (Ps)

f1 uorescens), встречающихся в ферментаци4О онном процессе лиvIOHIH OH кислоты.

Биохимические признаки. Хорошо сбраживает мелассные растворы при поверхностном способе культивирования. Выход лимонной КНслоты на 14,8% больше с единицы площади

45 мицелия, à HB меласоных средах штамм образует в среднем 97,8% лимонной кислоты от суммы кислот.