Способ идентификации вирусов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОЫРЕтЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 569596 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 28.11.75 (21) 2193798/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 25.08.77, Бюллетень № 31 (45) Дата опубликования описания 27,09.77 (51) М. КлР q 12 К 7!00

Государственный комитет

Совета Мннистроа СССР по делам изобретеннй и открытий (53) УДК.,576,858 (72) Авторы изобретения

В. Я. Кармышева, Л. М. Фарутина, T. А. Иванникова и М. И. Саталкина

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ

Изобретение относится к вирусологии и касается анализа биологических материалов.

Известен способ идентификации вирусов путем пассажа:вируссодержащего, материала на культуре клеток с последующим добавлением иммунной сывороткй.

Недостатком известного способа является длительность определения в связи с необходимостью внесения смеси вируса с сывороткой во вновь выращенные клеточные культуры и инкубации в течение 3 — 7 и более суток.

Целью изобретения является ускорение способа.

Для этого к зараженной клеточной культуре добавляют в избытке иммунную сыворотку, комплемент и краситель и идентифицируют вирус по наличию или отсутствию цитолитического эффекта.

Способ осуществляют следующим образом.

Взвесь клеток, чувствительных к предлагаемому вирусу, в концентрации 150000 — 200000 мл, рассаживают по пробиркам,.пенициллиновым флаконам с покровными стеклами или пластинами с лунками, Клетки выращивают на стандартных культуральных средах (Игла, 199 и т.д. с 10% нормальной бычьей сыворотки), на которых обычно выращивают используемую клеточную кулыуру.

Вируссодержащий материал пассируют на выращенной клеточной культуре до момента появления цитопатического эффекта или предполагаемого накопления вируса, затем культуральную ереду удаляют и споласкивают клетки той же культуральной средой без сыворотки; прогретой до 37 С. После этого к клеточному слою добавляют стандартные иммунные сыворотки.и комплемент в соотношении

1:1 в объеме, покрывающем исследуемые клетки, и помещают в термостат при 37 на 30 — 60 мин.

Сливают смесь сыворотки с комплементом, добавляют 0,025 о-ный раствор трипанового синего, че1ч .рез 2 мин сливают его и просматривают состояние монослоя в световом микроскопе. Наличие набухших, округляющихся лизированных клеток, окрашенных трипановым синим указывает на присутствие идентифицируемого вируса.

Каждую стандартную сыворотку рекомендуется использовать в 4 — 5 пробах.

Все сыворотки и комплемент морской свинки предварителыю проверяют на отсутствие неспецифической цитотоксичности на клеточные культуры, 569596

Составитель С, Малалина

Теяред Н. Андрейчук

Корректор С. Ямалова

Тирам 541 Подписное:

ЯНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по денем изобретений и открытий

1130 5, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 2973/17

Филиал ППП "Патент", r. Умгород, ул. Проектная, 4

Инактивацию сыворотки производят прогреванием при 56 С в течение 30 мин.

Время непосредственной идентификации вируса

1 — 2 час /не считая времени первичного культивирования вируса (12 — 17 час) .

Приме р. Идентификация альфавирусов.

Взвесь бычьей сыворотки (концентрация

150000 — 200.000 мл) в объеме 2 — 3 мл разливают по пробиркам. В пробирки . с выращенной клеточной культурой вносят исследуемый вируссодержащий материал в объемен 0,1 — 1 мл. 11осле адсорбции вируса вируссодержащий материал удаляют и монослой клеток в пробирках заливают ) укаэанной культуральной средой с 2% нормальной бычьей сыворотки. Через

12 — 17 час при появлении первых признаков цитопатического. эффекта культуру споласкивают укаэанной культуральной средой, прогретой при 37 С, и добавляют смесь одной из иммунных сывороток (к альфавирусам, вирусам клещевого энцефалита, кори) с комплементом в соотношении 1:1 в обьеме

1 мл (сыворотки при титрах 1:1280 по РПГА разводят 1:6 — 1:7, свежий комплемент морской свинки

1:5 — 1:7), Пробы ставят в термостат при 37 C на

30 — 60 мин. Затем жидкость удаляют, наливают на монослой 0,025%-ный раствор трипанового синего на физиологическом растворе на 2 мин и просматривают пробирки в световом микроскопе, определяя наличие или отсутствие сильно разбухших лизйрованных окрашенных клеток.

В примере лизированные клетки наблюдцдтся в пробирках, зараженных вируссодержащим материалом, с иммунными сыворотками к альфавирусам и отсутствуют в пробирках с сыворотками к вирусам клещевого энцефалита и кори, что свидетельствует о том, .го в вируссодержащем материале содержится вирус из группы альфавирусов.

1р Срок идентификации вирусов сокращается от

3 — 7 суток до 1 — 2 час. Это обеспечивает отсутствие вторичного заражения клеточных культур смесью вируса с сыворотками и следовательно отсутствие длительной ннкубации для развития цитопатическоИ го эффекта. При этом не требуется никакого специального оборудования или дополнительного обучения исполнителей.

Формула изобретения

Способ идентификации вирусов путем пассажа вируссодержащего материала на культуре клеток с последующим добавлением иммунной сыворотки, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, к зараженной клеточной культуре добавляют в избытке иммунную сыворотку, комплемент и краситель и идентифицируют вирус по наличию или отсутствию цитолитического эффекта.