Способ получения азотистых оснований

Способ получения азотистых оснований

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

пщ 570610

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВКДЕТЕЛЬСТВУ

Сова Советских

Социалистических республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.06.75 (21) 2140382/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 30.08.77. Бюллетень № 32

Дата опубликования описания 16.09.77 (51) М. Кл.з С 07D 471/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 547.857.07 (088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Г. Д. Бердышев, Н. А. Луценко и T. Б. Дьячковская

Киевский ордена Ленина государственный университет им. T. Г. Шевченко (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТИСТЫХ ОСНОВАНИЙ

Изобретение относится к получению биологически активных веществ, которые могут найти применение в биологии и медицине в качестве физиологически активных веществ, а также в химической промышленности как сырье для синтеза реактивов.

Известен способ получения азотистых оснований путем кислотного гидролиза нуклеиновых кислот, содержащихся в природном нуклеотидном сырье. Азотистые основания из полученной смеси гидролизата нуклеиновых кислот выделяют методом ионообменной хроматографии (1).

Недостатком известного способа получения азотистых оснований из полимерных нуклеиновых кислот путем кислотного гидролиза с последующим их разделением на ионообменных колонках является трудоемкость получения целевого продукта и использование для этого дорогостоящего сырья — полимерных нуклеиновых кислот, а сам процесс получения сопровождается использованием дорогостоящих реактивов и оборудования, что в конечном итоге обуславливает дороговизну получения азотистых оснований.

Цель предлагаемого изобретения — расширение сырьевой базы за счет утилизации промышленных отходов.

Согласно изобретению поставленная цель достигается тем, что азотистые основания получают путем кислотного гидролиза отходов производства протаминсульфата из молок рыб с последующим разделением полученной смеси азотистых оснований обычным методом ионообменной хроматографии.

В процессе получения протаминсульфата из молок рыб исходного сырья, согласно данному изобретению, молоки рыб подвергают обезжириванию, удалению рибонуклеиновой кис10 лоты, а также пигментов и в конечном итоге протаминов. B таком случае после горячей кислотной экстракции (3 — 5%-ной серной кислотой) протаминов из молок осетровых, сельдевых, лососевых и других рыб образуются бросовые отходы производства протаминсульфата.

Данные о химическом составе отходов производства протаминсульфата из молок рыб приведены в табл. 1. Общая влажность таких отходов составляет в среднем 36,5%.

В целях утилизации отходов производства протаминсульфата из молок рыб для получения азотистых оснований их хранят в тща25 тельно перемешанном виде в темных стеклянных банках в пределах температурного диапазона от 0 до +4 С, или же в высушенном виде (с содержанием влаги 2% в темных стеклянных банках с притертыми пробками при обычЗо ной температуре).

570610

Таблица 1

Отходы производства протаминсульфата из молок дальневосточных лососей

Зола

2,5

18,05

4,28

4,85

11

48

11

0,85

1,10

0,41

5,92

Нерастворнвшнйся осадок

Нативная ДНК

Полисахариды гп1 и, ммк

max, ммк

Аденин 262

Гуанин 248

Тимин 265

Цитозин 275

229

228

233

238

Химический состав отходов производства протаминсульфата из молок лососевых рыб, высушенных до постоянного веса

Природа исследуемого сырья, Общий азот

Общий фосфор

Жиры и липиды

Общая сумма кислоторастворимых продуктов деградации

ДНК

Азотистые основания, моль. тимин цитознн аденин гуаннн

РНК

Азотистые основания описываемым способом получают следующим образом.

Г1 р и м е р 1. 500 мг отходов протаминсульфата, высушенных до постоянного веса при 24 С и растертых в порошок, помещают в стеклянную ампулу с последующим добавлением по каплям до полного смачивания 72%

НС104. Далее из ампулы откачивают воздух.

Ампулу затем запаивают и помещают в кипящую водяну.ю баню для гидролиза ДНК отходов до азотистых оснований в течение 1 час.

Кислотный гидролиз можно осуществлять одновременно в нескольких ампулах.

После осторожного вскрытия ампулы гидролизат, полученный вышеописанным способом, разбавляют в 20 раз элюирующим буфером 0,2 М NH4C1 (рН 10,6), предварительно определив объем гидролизата, например эталонной ампулой.

Разбавленный в 20 раз элюирующим буфером гидролизат, содержащий азотистые основания, для отделения механических примесей и осадка центрифугируют в течение 8—

15 мин при 2000 g. Супернатант, содержащий смесь азотистых оснований в 0,2 М аммиачном буфере (рН 10,6), наносят на колонку

15;к,0,8 см с Дауэкс 1х,4 (300 меш, хлоридная форма) .

Смолу предварительно промывают поочередно кислотой и щелочью с целью освобождения ее от загрязнений, в особенности от веществ, поглощающих в ультрафиолетовом свете. Для этого смолу трижды промывают водой для удаления мелких частиц, затем трижды промывают 1 н. раствором аммиака, водой, 5

G0

4

1 н. раствором уксусной кислоты и водой до нейтральной рН промывной воды.

11осле последней промывки водой, не содержащей СО>, смола готова к употреблению.

Затем смолу переводят в хлоридную форму путем суспендирования ее в 1 н. НС!. Заполнение колонки смолой осуществляют в растворе 2 и. соляной кислоты под давлением гидростатического столба жидкости. Заполненную колонку промывают (уравновешивают) тем же раствором, который применяют для элюирования (0,2 М NH

NH4Cl, рН 1о,6) до тех пор, пока рН оттекающего раствора не станет равной рН подаваемого раствора.

Одни и те же колонки используют многократно после соответствующей регенерации.

Элюацию оснований осуществляют указанным выше 0,2 М аммиачным раствором. Скорость элюации 0,5 мл/мин. Фракции собирают на автоматическом коллекторе.

Процесс разделения азотистых оснований контролируют при помощи определения оптической плотности каждой фракции на спектрофотометре СФ-4. Идентификацию выходящих пиков азотистых оснований осуществляют по кривым поглощения в ультрафиолете с помощью бумажной хроматографии.

Полученные азотистые основания имеют следующие максимумы и минимумы оптического поглощения в ультрафиолете (на спектрофотометре СФ-4):

Фракции азотистых оснований объединяют, упаривают и идентифицируют. Таким образом, получают четыре фракции азотистых оснований с молекулярным соотношением цитозин— тимин — гуанин — аденин 10,5: 3,5: 7: 45. Сухой остаток, полученный в результате упаривания фракций, растворяют в небольшом количестве воды и наносят на бумагу в виде небольшого пятна. Параллельно испытуемым фракциям оснований наносят четыре свидетеля: аденин, гуанин, цитозин и тимин.

Для бумажной хроматографии используют следующие системы растворителей: абсолютный метанол + концентрированная соляная кислота + вода (70: 20: 5 V/V); изопропиловый спирт+ вода+ концентрированный аммиак (85: 15: 1,5 V/V). Положение пятна, испытуемых фракций оснований и свидетелей (14) выпадает.

В табл. 2 приведен выход целевого продукта из предлагаемого сырья, В конечном итоге из 50 мг высушенных до постоянного веса при 24 С отходов производства протаминсульфата из молок рыб получают цитозина 6 мг, тимина 10 мг, гуанина 6 мг, аденина 15 мг.

570610

Таблица 2 также путем измерения их ультрафиолетово-о спектра поглощения. Убедившись в высоком качестве полученных азотистых оснований, их подвергают ионообмен ной хроматографии описанным выше способом.

Выход азотистых оснований почти одинаковый с хлорной кислотой, т. е. 7% от веса сухих отходов.

Недостатком использования муравьиной кислоты для гидролиза ДНК отходов является неполное сжигание дезоксирибозы и некоторых других компонентов, что приводит к появлению углеобразного остатка, мешающего анализу. Кроме того, в муравьиной кислоте

15 невозможно проводить прямоточное спектросротометрирование азотистых оснований, как это удобно делать при использовании хлорной кислоты. Для муравьиной кислоты более сложная процедура упаривания гидролизата, 20 требующая создания атмосферы азота.

Гидролиз отходов можно проводить и некоторыми другими кислотами (серной, соляной), но использование пх имеет ряд существенных недостатков по сравнению с хлорной кислотой

25 (1разрушсние отдельных оснований, неполный гидролиз материала и т. д.), 11редложенный способ получения азотистых оснований характеризуегся простотой, удешевлением себестоимости целевого продукта и

30 позволяет расширить сырьевую базу и более полно и рационально использовать ценное сырье — молоки рыб.

Количес гь:нный выход азотистых оснований, о; от веса сухих отходов производства протаминсульфата из молок лососевых рыб

Колич ственный выход азотистых оснований, мг на

100 г сухих отходов производства протаминсульфата из молок лососевых рыб

Лзотисто о. и лиан;е

Цитозин

Тимин

1,2

2,0

1,2

3,0

3000

Гуанин

Ад<.н ни

Азотнс1ыс основания можно также разделить вышеописанным способом и на ионообменвой смоле ЭД3-101.

Азотистые основания из предложенного сырья можно получить также путем кислотного гидролиза и другими кислотами, например муравьиной, 11 р и м е р 2. Навеску отходов производства протаминсульфата из молок, высушенных до постоянного веса при 24 С и растертых в порошок, помещают в прочную стеклянную ампулу и к ней добавляют 88% муравьиную кислоту из расчета на 50 r отходов

50 мл кислоты. Ампулу запаивают с откачиванием воздуха и нагревают при 170 С 30 мин.

В этих условиях происходит полный гидролиз

ДНК до азотистых оснований, дезоксирибозы и остатков сросфорной кислоты, но одновременно муравьиная кислота разлагается с образованием СО>, вследствие чего происходит повышение давления внутри ампулы.

После окончания гидролиза ампулу охлаждают, вскрывают острым кончиком пламени горелки, после чего давление в ампуле становится равным атмосферному. Далее в токе азота при температуре 60 — 70 С гидролизат в ампуле упаривают, азотистые основания при перемешивании растворяют в 25 мл НС1, отцентрифуговывают от углеобразного осадка.

Супернатант вместе с азотистыми основаними собирают, упаривают при температуре

80 — 90"C в атмосфере воздуха. Далее азотистые основания идентифицируют хроматографией на бумаге совместно со свидетелями, а

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Составитель В. )Кестков

Редактор Л. Герасимова Техред Л. Гладкова Корректор T. Добровольская

Заказ 2080/2 Изд. № 721 Тираж 5á3

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

"" Количественный выход азотистых оснований из отходов производства проза., инсульфата из молок лососевых рыб, предварительно доведенных до постоянного в "ca при 2 1 С, на ионообменнзй смоле Даузкс

1 4 в хлоридноп форме.

Формула изобретения

1. Способ получения азотистых основа. In I путем кислотного гидролиза сырья, содержащего нуклеиновые кислоты, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью утилизации промышлеп40 ных отходов, кислотному гидролизу подвергают отходы производства протаминсульфата из молок рыб.

2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что кислотный гидролиз осуществляют кон45 центрированной хлорной кислотой.

50 1. "î÷åòêîâ Н. К., Торгов И. В., Ботвинник М. М. Химия природных соединений, М., 1961.

2. Ке1етеп Steve P., Degens Egon Т. КарЫ

column chromatography bases on «Ecteola» cel55 lulosa at room temperature and elevated pressure, «Nature», 1966, 211, Ма 5051, с. 857 — 859.