Нитрофурилполиенхинолинаспарагиназы,обла-дающие противолейкозной активностью

Нитрофурилполиенхинолинаспарагиназы,обла-дающие противолейкозной активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Сощиалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 060175 (23) 2093433/04 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет у М К 3

С 07 G 7/00

С 07 D 215/50

С 07 D 307/70

С 07 С 103/52 (БЗ) УДК ,722,2(088.8) il осударственный комитет

СССР ао делам изобретений и открытий

Опубликовано 300581 бюллетень № 2о

Дата опубликования описания 300581 (72) Авторы изобретения

И.К.Шпрунка, H.M.Ñóõoâà, Л.Я.Биндука, A.Æ,Äàóâàðòå, И.P.Ãàéëèòå и P.A.Æàãàò

Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза АН Латвийской ССР (71) Заявитель (54) НИТРОФУРИЛПОЛИЕНХИНОЛИНАСПАРАГИНАЗЫ> .", ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОЛЕНКОЗНОЙ AKTHBHOCTblO "

Это достигается нитрофурилполиенхинолинаспарагиназами общей формулы где R — Н, Cl, Alk, OAlk)

n = 1-3.

Способ получения указанных выше соединений основан на известных методах ацилирования L-аспарагиназы ангидридами и хлорангидридами кислот (5).

Приведенные примеры поясняют аци" лирование L-аспарагиназы производнымй нитрофурилполиенхинолин -4-карбоновых кислот.

Пример 1. К 6 мп полунасыщенного раствора Na-ацетата, содержащего 11280 м.е. Ь-аспарагиназы (3,2х

«10 И Ь-аспарагиназы; конц. белка

11,2 мг/мл уд. активность 168 м.е, мг белка), добавляют 78 мг (2,4 ° 10 И). хлорангидрида 2(2-(5 нитрофурил-2)-винил)-хинолин-4-карбоновой кислоты. Гетерогенную смесь перемешиваЦель изобретения — повышение про- 25 тиволейкоэной активности L-аспарагина» зы, создание гротивоопухолевых препаратов нового структурного типа и расширение средств воздействия на живой органИэм. 30

Изобретение относится к новым соез динениям — нитрофурилполиенхинолинаспарагиназам, которые могут найти применение в медицине в качестве противолейкозных и антибактериальных препаратов.

Известно применение L-аспарагиназ в качестве противолейкозных средств (11 . В качестве медицинской формы пролонгированного дейст вия известны также химически модифицированные L àñïàðàãèíàçû: например ациласпарагиназы )2), 15, азоаспарагиназы (3), амидоаспарагин азы (41.

Однако ни одна их этих- модификаций не повышает противолейкозного эффекта L-аспарагинаэы и не изменяет спектра.ее действия °

С=О

R (I 1 (СИ=СИ)п О К0

571071 ют 2 ч на ледяной бане. Центрифуги-руют 10 мин при 6000 хд. Надосадочную жидкость диалиэируют против

300 объема 0,05 М фосфатного буфера, содержащего 0,002 М L-аспарагиновой кислоты, затем против 0,002 М раствора L-аспарагиновой кислоты. Диали" зат содержит 11230 м.е. L-аспарагиназной активности. К нему добавляют

67 мг маннитола и лиофилизируют.

Препарат содержит 45,5 м.е./мг сухого веса или 164 м.е./мг белка Lаспарагиназной активности, имеет изоэлектрическую точку pj 4,70, Степень ацилирования ? ;Ъ .-КН, -групп.

Препарат увеличивает продолжительность жизни мышей на 15%. )5

Пример 2. Проводят как описано в примере 1.

K 7 мл раствора L-аспарагиназы (17760 м.е. Фермента или 1,9 AO M конц. белка Al 3 мг/мл; уд. акт. 2О

158 м.е/мг белка) добавляют 57 мг (1,85 ° 10 М) хлорангидрида 2 — (4-(5-нитрофурил-2)-1,3-бутадиенил)-хинолин-4-карбоновой кислоты. Лиофилиэиронанный препарат ациласпарагиназы содержит 127 м.е. /мг белка или

64м.е./мг сухого веса, имеет р,) 4,75, оптимум рй 7,0 ° Степень ацилирования

23Ъ ИН -групп. Препарат повышает выживаемость мышей-опухоленосителей на 56Ъ относительно нативного фермен30 та а

Пример 3. Проводят идентично примеру 1, но в качестве ацилирующегo агента добавляли 57 мг (1 86»

«

Р 35

«10 М) хлорангидрида 7-хлор-2 (2†(5-нитрофурил-2)винил)-хинолин-4карбоновой кислоты. Лиофилизированный препарат содержит 207 м.е./мг .белка или 93 м.е./мг сухого веса; имеет р3 5,33, оптимум рН 6,0. Сте- @) пень ацилирования 84Ъ NH<-групп„ Препарат повышает выживаемость мышей на

32Ъ.

Пример 4. Проводят идентично примеру 1 с использованием в качестве ацилирующего агента 57 мг (1,80» х 10 М) хлорангидрида 7-хлор-2-(4-(5-нитрофурил-2)-1,3-бутадиенил)—

-хинолин-4-карбоновой кислоты. ЛиоФилизиронанный препарат содержит

119 м.с./мг белка или 71 м.е./мг сухого веса; имеет р о 5,30, оптимум рН 7,5. Степень ацилирования 11,5Ъ

NH>-групп. Препарат повышает ныживаемость мышей на 38Ъ.

Пример 5. Проводят в усло55 виях, описанных в примере 1, с использованием в качестве ацилирующего агента 23,7 мг (70 мкм) хлорангидрида

7-метокси-2-(2-(5-нитрофурил-2))—

-винил-4-карбоновой кислоты на 1 Ы), 52 мкм 7-аспарагиназы (184 . м. е. /мг белка/конц. белка 16, 2 мг/мл ) .

Препарат после анализа стабилизируют добавлением 1 мг глицина/мг белка.

Препарат содержит 179 м.е./мг белка, имеет p D 5,35, степень ацилирования 7,5Ъ NH<-г рупп. Препарат продлевает выживаемость лейкозных мышей на 2ОЪ.

Пример 6. Проводят в условиях, описанных в примере с использованием в качестве ацилирующего агента 19 мг (10 мкм) хлорангидрида 2†(2-15-нитрофурил-2)-винил-7,8-диметилхинолин-4- карбоновой кислоты, на 1,03 мкм Ь-аспарагиназы (160м.е./мг белка, конц., белка 7,2 мг/мл).

Препарат содержит 79 м.е./мг белка

t р о 4,83„ степень ацилирования 22Ъ

NH -групп.

Пример 7. Проводят согласно методике, описанной в примере 1, с использованием в качестве ацилирующего агента 70 мкм хлорангидрида

2-(б-(б-нитрофурил-2) 1,3,5-гексадиенил)-хиналин-4-карбоновой кисло.ты на 1,52 xxM L-аспарагиназы. Полученный препарат содержит 97 м,е./мг белка; р J 5,20, степень ацилирования

16Ъ NH -групп.

Противолейкоэное действие нитрофурилполиенхинолинаспарагиназ изучено экспериментально на перевиваемую мышиную лейкемию L — 5178. В некоторых случаях использован резистентный к L-.àñïàpàãèíàçå подштамм лимфоидной лейкемии L — 5178 и асцитная опухоль Эрлиха. Как лимфоидная лейкемия Ь вЂ” 5178, так и асцитная опухоль Эрлиха прививались внутрибрюшинно в количестве 10 клеток на мышь.

Лечение подопытных мышей начато на

3-й день после прививки в случае лимфоидной лейкемии L — 5178 на 1-й день у мышей с асцитом Эрлиха. Фермент растворялся в физиологическом растворе хлористого натрия ех tempera и вводился внутрибрюшинно один раз в день ежедневно 5 дней подряд. Опыты с лимфоидной лейкемией L — 5178 произведены на мышах линий ДВА и

BALB а с асцитной опухолью Эрлиха— на беспородных белых мышах. Вес мышей 18-20 r. Количество мышей в подопытной группе 6, в контрольной

20.

Все исследования произведены в сравнении с нативной L- аспарагиназой,,из которой получены модификации„

Действие хлорангидридов 2-(6-(5-нитрофурил-2) 1,3,5-гексатриенил)-хинолин-4-карбоновой и 2-(2-(6-нитрофурил-2)-винил-7,8-диметилпиколин) -4-карбоновой кислот (примеры

7 и 6) изучено на штамме лимфоидной лейкемии L — 5178, который по своей генетической природе несколько отличается оТ штамма L — 5178, Опыты произведены на гибридах первог o поколения мышей линии ДВА и С ВС, Во всех случаях критерием эффекта служила продолжите льность жизни подопытных мышей. Продление жизни выраже° 571071 но н процентах по сравнении с длитель- ьишей. Полученные данные отображеностью жизни контрольных (нелеченых) Hbl B таблице.

1,Пример Химическое наэ

0 L 5178 1000

+11

3000

+1,5

-2,0

4000

«! !»

+18

1500

То же

Ь-аспарагиназа

+67

1000! !»

+ 23

3000

+24

4 00 0

L 5178, l500. +154

Т-аспарагиназа

+80

1500

1000

+94

3000

-8,5!!»

4000

+67

1000

Ь-аспарагиназа! !»

+23

3000

4000

+24

-15

Ь 5178 1500

+168

3000

Ь-аспарагиназа

-12,5

1500

L-аспарагинаэа

-19,5

3000

»е!»

Эрлих

1500!

+11

3000

-17

1500

Эрлих

L-аспарагинаэа

3000

Ь-аспарагинаэы амиды

2-(2 -(5-нитрофурил-2)-винил) — хинолин-4-карбоновой кислоты

Ь-аспарагиназы амид

2- 4 +- нитрофурил-2)- 1, 3- бут адие н ил) - хи нолин-4-карбоновой кислоты

Т;аспарагиназы амид

2-(4-(5-нитрофурил-2)—

-1,3-бутадиенил) -хинолин-4-карбоновой кислоты

L-аспарагиназы амид

2-(4-(5-нитрофурил-2-)"

-1,3-бутадиенил)-хинолин-4-карбоновой кислоты

L-аспарагиназы амид

2- (4- (5-нитрофурил-2-)1, 3-бутадиенил) -хи нолин-4-карбоновой кислоты

L-аспарагинаэы амид

2- 4-<5-нитрофурил-2)-1, 3-бутадиенил -7-хлор-хинолин-4-карбоновой кислоты

L 5178 1500 +16

3000 +64,5

5178 RBs 1500 +25!!- 3000 -20

571071 .

5 b

L-аспарагинаэа

1500 . +80

L 5178 1500

+38

То же

1 5178

1000

-3,5

+37,6

3000

1000

-1,0

Х 5178

3000

4000

Х -аспарагиназ а

5178

1000

+67

3000

4000

+24

500

Ф

+74,0

+86, 0

10.00

5178 Y 200

500

+86

+113

1.000

+160

0 е

+30

L-аспарагинаэа

500

+30

+38

1000

NH

С=О

L-аспарагиназы амид

2-(2-(5-нитрофурил-2)—

-винил) -7-хлорхинолин-4-карбоновой кислоты

4 L-аспарагиназы амид

2-(4-(5-нитрофурил- 2.)-1,3-бутадненил)-7-хлорхинолин-4-карбоновой кислоты

L-аспарагинаэы амид

2-(2-(5-нитрофурил-2)—

-винил)-7-метоксихинолин-4-карбоновой кислоты б 1-аспарагинаэы амид

2-(2-(5-нитрофурил-2)—

-винил)- 7,8-диметил хинолин-4-карбоновой кислоты

L-аспарагиназы амид

2-(6-(5-нитрофурил-2)-1,3,5-гексатриенил)-хинолин-4-карбоновой кислоты

Формула изобретения

Нитрофурилполиенхинолинаспарагиназы об @ей Формулы

К i !

М (ССК) Я 0

0 Ы02

Продолжение таблицы с

Х 5178 1500 +32

0 L 5178 У 200 +54, 5.

0 5178 У 200

rge R H Cl Alk OAlk

n = 1,3 обладающие противолейкозной актив,ностью.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.б. С.Wri seon, The Enzymes (ed.

by Bayer R.0.). Acod Press, М-Y, .

19 71, р. 101.

Н.Hakino, Н. Saeon, J . .Kuroi па, Sh. Jamarani, Jn. Tamaura, i и. Jnada

571071

as f ara-", ubsti

183, Составитель В. Волкова

Редактор Л.Письман Техред И. Келушак Корректор В.Бутяга

Заказ 3250/49 Тираж 397 . Подйисное

ВНИИПИ ГосударственногО комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, Ул. Проектная, 4

Immunochemi ca1 proper t i es of д! паве Ио411 е4 Ьу сЬев са1 s tutions, 1пипипосЬеа а гу, 12, 1975.

2, Патент ФРГ Р 1803782,. кл. 6 а 22/10, 1968.

3. кл, А

4 ° кл. 6

5. кл. б

Патент Франции Р 2081382, 61 к 19/00, 1970.

Патент ФРГ В 2039061, а 22/10," 1971.

Патент ФРГ 9 1807303; а 22/10, 1968.