Способ получения ферментационной жидкости, содержащей витамин в

Способ получения ферментационной жидкости, содержащей витамин в

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Оп ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАнЕНЗУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 21.10.74 (21) 2073162/13 (23) Приоритет — (32) 26.10,73 (31) R 1.524 (33) (43) Опубликовано 15.09,77, Бюл летень № 34 (45) Дата опубликования описания 05.08,77

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 573129

Ф (51) М Кл С 12 O 5/06 т йсудврст@енный ноинтет

Вюйата 1йнннстрав СССР нн делам нзобретеннй н атнрмтнй (53) УДК 577 16(088.8) Иностранцы

Бела Иохан, Ласло Семлер, Тамаш Сонтаг, Ласло Кути, Эмилия Шимоновнтш, КЬнт Бекеш, Депеш Секель, Янош Кишш, Эржебет Ковач и Анико Хлргтнтай (ВНР) Инопредприятие

"Рихтер Гедеон Ведьесетн Дьяр РТ"

ВНР (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИОННОИ ЖИДКОСТИ

СОДЕРЖАЩЕ11 ВИТАМИН В г

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения ферментационной жидкости, содержащей витамин В» повышенной концентрации, Известен способ получения витамина В,, либо путем стерильной ферментации монокультур, либо с помощью смешанных бактериальных популяций, выделенных из сточных вод и приспособленных к специальной питательной среде 11) .

Однако нри использовании смешанных бактериальных популяций выход витамина В» нельзя увеличить за счет повышения индивидуальной производительности отдельных видов бак терий, как это обычно имеет место при стерильной ферментации монокультур.

В смешанных популяциях метаболизм отдельных видов микроорганизмов может быть независимым, но не от любого нз других присутствующих видов. Это взаимодействие в некоторых случаях может носить как положительный эффект — в результате чего повышается выход требуемого продукта, так и отрицательный, например, в процес. сах септической ферментации, где обычные инфицирующие бактерии не могут размножаться в ферментацнонных жидкостях.

Известен способ получения ферментацноиной жидкости, содержащей витамин В а, путем анаэробной ферментации смешанной культуры анаэробных метановых бактерий на питательной среде

5 в присутствии метанола t21.

Недостатком указанных способов получения в настоящее время витамина В1з в процессах ферментации, проводимых с метанпронзводящимн является то, что получаемые ферментационные

10 жидкости содержат всего лишь 10000 — 11500 мкг/л витамина В z.

Целью изобретения является разрабоп а такого способа, который позволил бы значительно синхронизировать цикл размножения бактериальной мас1ь сы в ферментацнонной жидкости и увеличить концентрацию бактерий в ферментационной жидкости и тем самым повысил бы выход витамина В, . Цель достигается тем, что в известном способе получения ферментационной жидкости, содержащей вита. мнн В1, получаемой путем обычной анаэробной септической ферментацнн со смешанной метанпроиэводящей бактериальной популяцией ферментацию осуществляют постадийно: на первой стадии проводят отбор ферментационной жидкости в количестве 5 — 15%, преимущественно 10%, с за573129

114

164

186

232

256

304

326

348

Э меной ее концентрированной питательной средой, содержащей необходимые питательные вещества, предпочтительно десятикратной концентраци"-, и метанолом в количестве 0,5-1,5 об,%, на второй стад и, преимупФственно через 24ч, ферментационную жидкость не отбирают, а добавляют только лишь метанол в количестве 0,5 — 1,5 об.%, на третий стадии — в последующие 5 — 10 дней вновь осуществляют отбор 5 — 15% ферментацнониой жидкости с добавлением 0,5 — 1,5 об.% метанола и соответствующего отобранному количеству жидкости объема питательной среды.

Прн этом концентрированную питательную сред целесообразно вводить прн рН среды, преимущественно равном 5,5 — 5,8.

Благодаря такой посхыдозятельности з постадийиой подкормке Обеспечив яс тся постепенное сньэцюннзирование цикла размножения всех быктериальных популяций, и реэультатс чего постепенно нарастает концентрация бактерий н соответственно этому также концентрацня витамина В а в ферментацнонной жидкости, Высокая концентрация бактерий в ферментационной жидкости может быть досп гнута также ж счет того, что нз дру-.ой ферментацио щой жидкости, получаемой благодаря осуществляемой иэ ° весгпым методом ферментации, отделяют живые бактертщ, например, це нтрифугпрованием и готовят концентрат бактерначыпя клеток примерно с

Таким образом, иэ таблицы видно, что необходимое количество метанола для ежедневной добавки в пересчете на весь объем ферментационной жидкости составляет 0,4 — 1 „5 об, o.

Предлагаемый способ имеет преимущества перед иэвестнымп: позволяет получить вь сокие концентрации витамина В, s ферментацнонной жидкости порядка 30 000 — 40 000 мкг/л, позволяет применять смешанные бактернальные нопуляц пт в промьпцченных ферментационньис процессах.

Пример 1. Цля проведения процесса ферментащп берут ферментаторы с цалеэтым объемом

10л каждый, снабженные трубками для отвс,да

80000-90000 мкг/л витаьжиа Â ®. Получаемый концентрат добавляют в ферментационную жил; кость, являющуюся исходной средой, с таким рас,четом, чтобы концентрация витамина В а в среде достигала требуемого значения, например

30000 мкг/л. После этого можно сразу же перейти на цолунепрерывную постадийную фермеитацию, Важную роль в предлагаемом способе играет дозировка метанола, вводимого как в подготови1о тельных фазах способа, так и во время продолжаю. щейся согласно изобретению полунепрерывной ферментацни в ферментационную жидкость. Проделаиные опыты подтвердили, что имеется однозначная и линейная взаимосвязь между количествами ежедневно вводимого метанола и выделяемого так называемого биогаза, по объему которого в единицу времени можно однозначно судпь о количестве мета. иола, потребляемого бактериями. Поэтому целесооб разно вводить метанол порциями, которые необто ходимы только для замены потребляемого количества, поскольку избыточная дозировка может привести к скоплению метанола в ферментационной жидкости, а избыток метанола может оказывать" токсичное воздействие на популяцию бактерий.

Табл. 1 показывает зту взаимосвязь в пересчете на

1 л ферментационной жидкости. С йомощью этой таблицы можно, исходя из объема газа, получаемого в 1 л ферментационной жидкости за 1 ч, определить количество метанола, которое необходимо

30 вводить ежедневно в ферментационную жидкость.

Таблица 1

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

i,5 газа,. и заполняют соответственно 10л ферментацнонной жидкости, получаемой, известным способом путем лолунепрерывной ферментащи со смешанной мсзофнльной метанпроизводящей лопуляидей и содержащей 9940 мкг/л витамина В1, Согласно изобретению в исходную среду вводят добавку (при одновременном отборе такого же количества ферме пационной жидкости) питательной среды следунйцего химического состава:

Концентрат кукурузного жидкого экстракта, г/л 5

Гядролиэат ннвных дрожжей, мл/л 1

60 Меласса, г/л 2

573129

О работанный сульфатный щелок, г/л 1,6

Экстракт печени, 10% — ный, г/л 1

Гидроокнсь аммония, 24%-ная, мл/л 1,1

Ъдаммониевый гидрогенфосфат, r/ë 2 . Гидрокарбонат аммония, г/л 3

Сульфат аммония, r/ë 1,5

Гидросульфит натрия, г/л 0,02

Хлорид магния, г/л 0,1

Хлорид кобальта, г/л 0,01 1о

Ангидрид янтарной кислоты, г/л 0,006

Глицин, г/л 0,006

5 6 - Диме тилбензимидазол, r/ë 0,003

Наряду с этой питательной средой, называемой

NB f a ферментационную жидкость (рабочую среду) ежедневно вводят 0,6 об.% метанола. Ферментеры А и В заполняют соответственно каждый 10 л ферментационной жидкости, выдерживают прн 32 — 34 С и в течение трех дней вводят в иих ежедневно лишь

50мл метанола. На четвертые сутки отбирают 1 л ферментационной жидкости и вводят такой же объем концентрированной питательной среды следующего состава (NB е):

Концентрат кукурузного жидкого экстракта, r

Гидролизат пивных дрожжей, 20 ный, мл 10

Меласса, r 20

Отработанный сульфнтный щелок,г

Экстракт печени, 10% — ный, мл

Гидроокись аммония, 24% — ная, мл 11

Диаммониевый гидрогенфосфат (двухэамеще нный фосфорнокислый аммоний), г 20

Гидрокарбонат аммония, г 30

Сульфат аммония, г 15

Гидросульфат натрия, r 1,0

Хлорид магния, r 10

Хлорид кобальта, r 0,1

Ангидрид янтарной кислоты, r 0,06

Глицнн, r 0,06

5,6 - Диметилбензомидазол 0,03

Вода, мл До 1000

Предварительно замеряется объем газа, выходящего через газоотводную трубку, и, поскольку количество газа, образуемого за час, в пересчете на

1 л ферме папнонной жидкости составляет примерно 160 мл,то одновременно с питательной средой ЙВ,О вводят так же и 70 мл (0,7 об.%) метанола. В последующие 5 дней, т.е. на 5, 6, 7, 8 и 9-е сутки опыта вводят только добавку метанола без отбора жидкости, а именно в количествах, соответствующих скорости выделения газа согласно табл, }. На десятый день снова отбирают 1 л ферментацнонной жидкости, добавляют 1 л питательной среды ЙВ, 0 и соответствующее количество метанола. То же самое Йовторяют и на 17 — ый и

25-ый день, причем в промежутках — в 11, 12, 4

}1

14

16

18

21

22

} 1700

}9872

23124

21432

}3-ый днн и далее в 18, 20, 21, 22, 23 и 24-ый дви снова вводят без о|бора ферментационной жндкосзи лишь соответствующие когичества метанола.

С 25 дня начинают осуществлять полунелрерывную ферментапию. На 26-ой день добавляют только метанол беэ отбора жидкости, затем с-27 по 32 день отбирают ежедневно 1 л ферментационной жидкости, добавляют 1 л питательной среды NBj и необходимое количество метанола, на

33 — ий день после отбора 1 л ферментационной жидкости снова вводят 1 л питательной среды NBq е. Далее цикл повторяется.

В течение времени, а именно с 25 по 75 день, определяют содержание витамина В, q в отобранной ферментационной жидкости, Прн этом имеет место лишь незначительное расхождение концентрации витамина В q в ферме пационных жидкостях, средние значения составляют, мкг/л: для ферментера А 43268 для ферментера В 43543

Пример 2. Способ осуществляют согласно нримеру1, но с той лишь разницей, что на 4-ый день осуществляют полунепрерывную ферментацию, как в 25 — ый день, по примеру 1. В этом случае концентрация витамина В> q в ферментационной жидкости, получаемой известным способом и используемой в качестве исходной рабочей среды, составляет 10 600 мкг/л.

Наряду с периодически чередующейся добавкой питательной среди МВ е и соответственно NB> ежедневно вводят следующие количества метанола:

День опьпа Метанол, мл

3 — 9 80

10 — 12 100

13-14 120

15 130

16 140

17 150

Ежедневно вводимые в процессе опыта количества метанола выбирают по табл, 1.

В этом опыте непрерывно определяют содержание витамина В 2 в ферментационной жидкосж.

В табл. 2 показано постепенное повьцпенне кон- центраш и вплоть до 50 — го дня опьгга.

573129

Продрлжение таблицы 2.

Продолжение таблицы 3.

5

7

22632

40424

21016

21200

31 26400 . 32 27700

35 25944

Зб 26600

37 32800

38 32200

39 33270

43 28152

44 304ОО

45 зггоо 15

46 27200

49 30500

50 31600

П р н и е р 3. Ферментатор с полезным объемом

10 л, снабженный трубкой для отвода газа, запол- щ няют 4500мл ферментационной жидкости, получаемой известным способом посредством полунепрерывной ферментации со смешанной меэофильной метанпроизводящей бактериальной популяцией при использовании упомянутой в примере 1 нита- 25 тельной среди NB,, содержащей 9940 мкг на 1л витамина В». Затем вводят при 32 С добавку в виде 500 мл бактеривльного концентрата, содержащего 88000 мкг/л витамина В1, При этом этот концентрат берут из другого ферментатора. К

500 мл рабочей среды, содержащей теперь

18500 мкг/л витамина В», добавляют 500 мл питательной среды йВ,О и 75 мл метанола питательной среды NB,p и 75 мл метанола. На второй и третий день ферментации жидкость не отбирают и осу-35 ществляют ежедневную добавку лишь 75 мл метанола.

С 4-го по 10-ый день отбивают соответственно по

500 мл ферментационной жидкости и заменяют тем жь объемом питательной среды NB> и 75 мп метанола. 4О

В 11-ый день при той же порции отбнраемой жидкости добавляют снова концентрированной питательной среды NB> е и обычное количество метанола. Далее цикл повторяется, как в примере 2. 45

В табл. 3 показан один из вариантов постепенного нарастания концентрации витамина В z в ежедневно отбираемых порциях ферментационной жидкости.

Таблица 3 50

Пример 4. Промышленный ферментатор с

50м полезного объема заполнен 50М ферментацнонной жидкости, служащей исходной средой, получаемой аналогично первым примерам и содержащей 9936 мкг/л витамина В». В первые три дня согласно изобретению добавляют по 25 л метанола, (для облегчения перемешивания метанола и устранения локальной избыточной дозировки целесообразно разбавлять метанол добавкой двух-трехкратного количества воды, в этом случае, однако, следует отбирать соответствующий объем ферментационной жидкости с тем, чтобы избежать превышения всего объема). На четвертый день отбирают

5 м ферментационной жидкости, добавляют равный объем питательной среды NB 0 и 400 л метанола. Затем на 10 — ый, 14, 21 и 27 — ой дии отбирают снова 5 м ферментационной жидкости (добавляя обычное количество метанола), а на 5-9 — ый,,11- 13 — ый, 15 — 20 — ый и 22 — 26 — ой дни добавляют только метанол в указанной последовательности. С

27 дня начинается обычный периодический цикл, т,е. на 27, 33, 42, 46, 50, 59, 65 и 75 дни добавляют беэ отбора жидкости лишь метанол, а в остальные дни ферменгационного процесса, проводимого вплоть до 77 дня, отбирают по 5 м фермеитационной жидкости и это количество заменяют равным объемом питательной среды NB>. Количество ежедневно вводимого метанола составляет максимально 750л, при этом соответствующие количества определяют по табл. 1.

Содержание витамина B, s ферментационной жидкости составляет прижрно 30 000 мкг/л. С

46 — го дня до конца опыта было получено среднее

12

13

14

17

21

22

23

26

27

28

29

30 зз

34

36

37

43

27ООО

33400 згооо

35548

30968

34166

ЗО8ОО

30500 ззооо

57 1129

Составитель М. Ларина

Техред А. Богдан

Корректор А. Кравченко

Редактор Т, Девятко

ТИРаж 541 Подписное

БНИИПИ Государстве нного коьитета Совета Министров СССР но делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раупккан наб., л. 4/5

Заказ 2344/697

Филиал ППП "Патент", г. Ухттч1ол. ул. Проектная, 4 значение (лиив с небольшим отклонением) 32750 мкг/л.

Формула изобретения

1, Способ получения ферментационной жидкости, содержащей витамин В а, путем анаэробной ферментации смешанной культуры анаэробных метановых бактерий на питательной среде в присутствии метанола, отлича ющийся тем, что, с целью увеличения концентрации бактерий в ферментационной жидкости и, соответственно, повышения выхода витамина В а, ферментацию осуществляют постадийно: на первой стадии проводят отбор ферментационной жидкости в количестве

5 — 15% с заменой ее концентрированной питательной средой, содержапа:й необходимые питательные вещества, преимущественно десятикратной концентрации, к метанолом в ко шчестве 0,5 — 1,5 об.%, на второй, преимущественно через 24 ч — без отбора жидкости с введением метанола 0,5-1,5 об.%, на третьей стадии — в последующие 5-10 дней вновь осуществляют отбор 5-15% ферментационной жидкости с добавлением 0,5-1,5 об.% метанола н соответствующего отобранному количеству жидкости обьема питательной среды.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что концентрированную питательную среду вводят при значениях рН среды преимущественно равном

5,5-5,8.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Австрии Яе 266311, кл, 30 F 9, опубли к. 1969.

2. Авторское свидетельство М 338114, кл. С 12 О 5/06, заявя. 1969.