Патент 575037

Способ получения зеаксантина

 

О П И C А:: И:-И-."Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советскик

Социалмстимескик

Республик (111 575037

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 27 10.72 (21) 1853187/15 (23) Приоритет — (32) 27,10.71 (31) 015626/71 (33) Швейцария (43) Опубликовано 30.09.77. Бюллетень № 36 (46) Дата опубликования описания 29.09.77 (31) М. Кл.

С 12 9 5!юО

Государственный комитет

Совета ееииистров СССР оо делам изаоретений н открытий (53) УДК

577.161.12 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Ярослав Дазек, Давид Шефер н Кнут Рюд Трзльн (Швейцария) Иностранная фирма

"Сосьете дэ Продюн Нестле, С.А." (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗЕАКСАНТИНА

Изобретение касается способа получения желтого пигмента, именуемого зеаксантином или 3, 3дигидрокси - Р - каротина, путем культивирования микроорганизма, производящего это вещество.

Такой пигмент можвт быль использован, например, в качесше добавки в корм для кур с целью иитенсифицировання желтой окраски их кожи для интенсифицирования окраски желтков яиц. Кроме того, зеаксантин можно применять в качестве красителя, например, в косметической промышленности.

Синтез пигмейтой некоторыми микроорганизмами и, в частности синтез каротиноидных пигментов бактериячи вида Flavobacter известен, Однако промышленное производство этих пигментов путем биосинтеза представляется обычно тонким делом и достигаемые выходы малы и для получения существенных количеств пигмента приходится прибегать к очень большому количеству сред для культивирования.

Изобретение относится к получению эеаксантина путем бносинтеэа простым способом с повышением выхода пигмента, Изобретение касается способа получения зеаксантина путем культивирования производящего этот пигмент микроорганизма вида F lavobacter, при котором микроорганизм культивируют в питательной среде до получения клеток на стадии роста производства зеаксантина, после чего эти клетки кулммвируют тпэн температуре 22 — 25 С в условиях достаточного насьпценяя кислородом в ферментацнонной питатеш ной среде, содержащей не менее 25 — 35 мг/мл углерода, являющегося источником усвояемого углерода, источник ассимилнруемого аминированно.

lp го азота, содержащего свободные аминированны кислоты; содержание этих веществ по держивантг примерно в постоянном отношении, постепенно вводя их в процессе культивирования в ферментацнонную среду, причем культивирование про15 должают до накопления в среде достаточного-количества эеаксантина.

Микроорганизм вида F!avobacter представляет со. бой микроорганизм, иэбракньш среди бакретий этого вида, или мутант подобного микроорганизма.

20 Выражение "в условиях достаточного насьпцения кислородом" означает, что содержание кислорода в культиви;чуемой среде никогда m опускается ниже порогового значения, ниже которого оно становится фактором, ограничивающим степень роста микроорганизмов в условиях культивирования.

575037

Условия достаточного насыщения кислородом могут быль, например, обеспечены продуванием возруха и энергичным размешнванием культивируемойй среды. "Питательная среда" означает среду культивирования, содержащую вещества, необходимые дпя жизнедеятельности микроорганизма ими ассимилируемые. Среди таких веществ можно назвать источники углерода, азота и минеральные соли.

Однако питательная среда может содержать и иные вещества — витамины, факторы роста и микроэлементы.

Согласно изобретению гбговят культуру микроорганизма вида Flavobacter, 1соторуто потом инокулируют и питательную среду, помещенную в ферментер и содержащую в качестве источника усвояемых микроорганизмами углерода и азота, Рост микроорганизмов в ферментере поддер жйвают путем достаточного насьпцения среды культивирования кислородом и поддержанием над1тежащей температуры — порядка 28 и 30 С и соответ ствующего р Н.

Когда mymbtypa вступит а фазу экспоненциального роста и клетки достигнут стдин производства зеаксантина (легко обнаруживающую, благодаря желтой Окраске этого пигменте), культивирование клеток продолжают в условиях достаточного насыщения;кислородом при температуре от 22 до 25 С в водчой питательной среде, содержащей от 15 до

35 мг/мл хотя бы одного .углевода и источник усвояе мого а минированного азота, соде рхсащего свободные аминокислоты, причем неизменное соотношение соответствунлцих количеств обес- печивается последовательной добавкой обоих веществ в питательную среду.

Углевод, который является основным источником усвояемого микроорганизмом углерода, может избираться среди таких веществ как глюкоза, лактоза и сахароза. Основным источником усвояемого углерода может также быть смесь этйх веществ.

Среди веществ, приемлемых в качестве компонентов основного источника аминного азота, можно указать, например, настой от вымачивания кукурузы, экстракт дрожжей, гндролнзаты протеина, в частности продукты, полученные при кислотном или ферментативном гидролизе протеинов растительного происхождения, например протеины сои или арахиса и/или гндролизат казеина ("трилтон"). Этот источник аминного азота может также содержать вещество, приготовленное путем кислотного или ф" рментативного гидролиза биомассы, выделенной в качестве побочного продукта биосинтеза каротиноидного пигмента при культивировании бактерии вида F lavobacier, в частности путем гидролиэа биомассы Flavobacter, культивирсванной с целью получения зеаксантина, из которой пигме п уже выделен, Затем культивированг-. продолжают в этих условиях в течение времени, достаточного для получения в культивируемой среде значительногс

55 б

20 В количества зеаксантина, содержащегося в клетках пигмента. К концу этого периода можно прекратить добавление источников углерода и азота, дав композиции культивируемой среды развиваться по мере потребления микроорганизмами питательных веществ.

Во время ферментации рН культивируемой среды регулируется в пределах 6,5-8,0, предпочтительно между 7,0 и 7,5. Регулирование рН может быть обеспечено с помо|цью щелочных растворов, например водных растворов едсого патра, едкого кали илн гищюокиси RMMommm или с помощью струи аммиака, пуедйочтительны два последних вещества, поскольку Они одновремент1о; — источники ассимилируемого микроорганизмами аминного азота.

Затем это культивирование продолжают в rewHHe BpcMeHH gocTa oamoM для образования . B среде значительного количества зеаксанта. Культивирование можно продолжать и после прекращения добавления питательных веществ.

Исключительно интересные результаты получены при описанном выше культивировании в случае воздействия 1 - метил - 1 - нитро - 1 - нитрозогуандина (МННГ) на некоторые бактерии вида

lavobacter по способу мутации, заключающемуся в том, что воздействие МННГ на бактерии проводят в отвержденной среде.

Согласно специальной форме осуществления этого способа мупщии готовят культуру бактерии вида F lavobacter, производящей зеаксантин.

Эту культуру разбавляют в стерильном физиологическом растворе и полувоенный раствор потом смешивают в надлежащем отношении в чашке

Петри с водным раствором МННГ, например с эквивалентным объемом водного раствора МННГ, содержащим 1 — 10 мг этого вещества на 1 мл, Затем в полученный раствор выливают расплавленньй агар, которьй пцательно смешивают с раствором.

После затвердевания агара полученную твердую среду поддерживают при температуре инкубации

25 — 28 С до появления в среде к.олокий. Колонии затем забирают и несколько раз подряд пересаживают на твердые питательные подложки.

Мутантньй микроорганизм может стать объектом одной или нескольких последующих операций мутации в затвердевшей среде.

Результаты экспериментов показали, что мутация, осуществленная в затвердевшей среде с помощью мутагенного агента позволяет получить из бактерий вида F 1avobacter мутанты, производящие в идентичных условиях культивирования зеагссантин в количестве, намного превосходящем результаты действия мутантов, полученных при обыч1чых способах мутации из тех же бактерий н с помош;ью того же мутагенного агента.

Результаты экспериментов показали, что пр|и культивировании мокроорганизма предлагаемым способом производство эеаксантина намного пре575037 вышает выход его из культуры того же микроорганизма, но при обычно практикуемых условиях.

После концентрирования бульона культуры экстрагируют из клеток эеаксантин с помощью полярного органического растворителя, например ацетона, этилового спирта или хлорированного растворителя, например хлороформа.

Сепарирование биомассы из культуры можно осуществить, например, центрифутированием, декантацией или фильтрованием. Биомасса может использоваться в качестве добавки к корму для кур, или может быть подвержена экстрагированию с помощью полярного органического растворителя.

Пример 1. Готовят начальную культуру вида йачоЬастег (АТСС Р 21588), которую пересаживают в количестве 5 об.% в находяшуюся в ферментере водную питательную среду. Питательная среда, предварительно простерилизованная в течение 40 мин. при 120 С и потом охлажденная до

28 С, рН регулируемым с помощью аммиака в диапазоне 6,9 — 7,1 имела следующий состав,%:

Глюкоза (отдельно стерилизованная в концентрированном растворе) 7,0

Настой от вымачивания кукурузы 1,6

Гтщролизат казеина (триптон) 0,8

Экстракт дрожжей 1,8

Сернокислый магний 0,5

Кукурузное масло 0,08

Вода водопроводная До 100

Микроорганизм культивируется в ферментере при 28 С продуванием воздуха при энергичном размешивании с непрерывным регулированием рН в диапазоне 7,2 — 7,3 путем систематического добавления разбавленного водного раствора аммиака, Осуществленная в таких условиях культура обладает 6 — 7-часовой латентной фазой, пронзвод-! ство зеаксантина начинается через 14 час культивирования.

Когда содержание глюкозы в ферметационной среде достигнет, уменьшаясь 25 кг/мл; т.е. через

24 час после начала культивирования, температуру среды доводят до 24 С н в ферментер постепенно вводят питательный субстрат, пред" аонтельно простерелнзованный в отдельном сосуде так, чтобы содержание глюкозы было постоянным. Состав питательного с, бстрата,%:

Глюкоза 32

Настой от намачивания кукурузы 4,7

Гидро.".иэат казеина (тоиптон) 4,3

Экстракт дрожжей 5,5

Вода водопроводная До 100 рн 7,7

Постепенную добавку состава продолжают в течение 20 ч з, причем температура поддерживается

24 С.

После суммарного культивирования в течение

50час измеряют содержанием эеаксантина в культуральной среде. Для этого биомассу отделяют от питательгто субстрата путем центриф ..нровання и

И рн ме р 2, Культуру вида Flavobacter (АТСС

Р 21081) готовят в водной питательной среде (с рИ поддержнвавшемся на уровне 6,5), имевшей следующий состав,%:

Глюкоза 3,0

40 Экстракт 4Po>K>Kaé 1,0

Гидролизат каэеина (триптон) 1,0

Сернокислый магний 0,5

Г >да водопроводная До 100

Культуру, содержащую 5 г клеток -микро. организмов на 1 л питательнои среды, разбавляют в .отношении 1:10 (по объему), путем ряда последовательных операций, в фиэнологическоь. стерильном растворе, содержащем 0,9 вес.% хлористого натрия. Затем тщательно смешивают 1 мл moro

1б с0

30 зеаксантин экстрагируют из клеток ацетоном.

Раствор зеаксантина в ацетоне определяют путем колорометрического сопоставления с титрованными растворами синтетического зеаксантина в том же растворителе.

Измеренное таким образом содержание эеак сантим в ферме нтационной среде составило

20 мкг/мл, Дпз сравнения, также начальная культура выращивалась общепринятым способом. С этой целью ею инокулировали 5.об.% в таком же количестве предварительно простернлизованной и охлажденной до 28 С питательно.. среды рН, регулнровавшемся в пределах 6,9 — 7,1. Композиция имела следующий состав,%:

Глюкоза 10,0

Настой от вымачиваниА кукурузы 1,85

Гндролизат казенна (трниточ) 1,25

Экстракт дрожжей 2,1

Еернокисльш магний 0,5

Кукурузное масло 0,08

Вода в одопров одная До 1000

Кульп вирование проводилось с размешиванием нрн энергичном продувании воздуха с Herl1>ерывным регулированием рН до уровня 7,2 — 7,3.

Длительность латентной фазы 8 час. Получение эеаксантина начиналось через 15 час. Температура среды поддерживалась спустя 24 час с начала культивирования на уровне 24 С, Через 55час после начала культивирования содержание зеаксантина в ферментационной среде (определенное вышеуказанным образ м) равнялась 12 мкг/мл, раствора с 1 мл водного раствора МННГ, содержащего 5 мг/мл этого вещества в чашке Петри. Потом на нриготовленный таким образом |раствор выливают 10мл абгара н производят тщательноесмешивание arapa с раствором. После затвердения агара ча -асу Петри ннкубнруют прн температуре порядка 25-28 С до появления в отвержденной среде колоний, т.е. через двое-четверо суток. Затем колоюи отбирают иэ чашки Петри и помещают (путем ряда последовательных операций) на питательные агаровые подложки в отсутствии МННГ.

575037

Полученный мутант потом ннокулнруют в количестве 5 об. в 100 мл стерильной питательной среды рН, поддерживаемым на уровне 6,5, имеющей следующий состав,%:Глюкоза 3,0

3KcfpkKT дрожжей 1,0

11адролизат казениа, (триптон) 1,0

Сврнокислый магний 1,0

Вода водопроводная До 100

Микроорганизм культивируют в этой среде при

28 С в аэробиых условиях в течение 24 час, потом эта культура Вновь переносится В 2 л нитательиой среды такого жв состава. Спустя 24 час ферментации, осуществленной s тех же условиях, культура нереиосится 5 Об.% в находящуюся в ферментере питательную среду. Питательная среда, предварительно простерилиэованная в течение 40мин при

120 С и охлажденная до 20 С рн регулируемым аммиаком иа уровне 6,9 — 7,1, имеет следунициф сОстав,%.

Глюкоза (предварительно простерилизованная в концентрированном растворе) 7,0

Настой m вымачивани» кукурузы 1,0

Гидролнзат казеина (триптон) 0,8

Экстракт дрожяюй 1,8

Сернокислый магний 0,5

Кукурузное масло 0,08

Воца водопроводная До 100

Культивирование производят в- ферментере при

28 С с аэрнрованнем, энергичным размешиваиием и автоматическим регулированием. рН среды на уровне 7,2-7,3. Длительносп латентной фазы

5 — 6 час, образование зеаксантина начинается через

12 час после начала культивирования.

Когда содержание глюкозы в этой культуре достигнет, уменьшаясь, 25 кг/мл, т.е. через 22час после начала культивирования температуру среды доводят до 24 С, и в нее с таким расчетом, чтобы сохранить примерно постоянный уровень содержания глюкозы, вводят предварительно простерилизованный питательный субстрат, рН которого регулируется на уровне 7,2, имеющий следующий состав,%:

Глюкоза 32

Настой от намачивания кукурузы 4,7

Гидролнзат казеина (триптон) 4,3

Экстракт дрожжей 4,5

Вода водопроводная До 100

Состав вводят постепенно в течение 20 час, причем температуру среды поддерживают на уровне

24 С. После суммарного культивирования в течение 48 час концентрация глюкозы в среде достигает

6 Mf/ìë, а содержание эеаксантина, измеренное описанным в примере 1 способом, составляет

335 мкг/w..

П р н м е р 3. Описанным в примере 2 образом готовят мутант Fiavobacter (АТСС 21081).

10

Мутант инокулируют в 4 об.% в водную, предварительно простернлизованную в течение 40 мин при 120 С, питательную среду и охлажденную до

28 С и помещают в ферментер. Эта питательная среда с рН регулируемым с помощью аммиака, в пределах 6,9 — 7,1 имеет следующий состав,%:

Глюкоза 7,8

Настой от вымачнвания кукурузы 1,8

Гидролизат жмыха 0,7

Экстракт дрожжей 2,0

Сернокислый магний 0,5

Кукурузное масло 0,08

Вор водопроводная Qo 100

16 Микроорганйзм культивируют в ферментатбрв нри 28 С, как Описано в примере 2.

После того, как содержание глюкозы в среде достигнет 25 мг/мл, температуру среды доводят до

24 С и в аее постепенно чтобы обеспечить при0 мерно постоянный уровень содержания глюкозы, ВВОдят предварительно простерилизованный пи тательный субстрат, с рН регулируемым на уровне

7,2% следующего состава,%:

Глюкоза 12 чб Настой от вымачивания кукурузы 4,7

Гидролизат жмыха арахиса 3,5

Экстракт дрожжей 6,0

Вода водопроводная До 100

Добавку осуществлять в течение 20 час при температуре 24 С..

Спустя 51 час общего культивирования, содержание глюкозы sсреде доходит до 7,,5 мг/мл.

Содержание зеаксантина, определенное по описанному в примере 1 способу, равняется 312 мкг/мл.

Пример 4. Приготовленную культуру бактерии НачоЬастегшя aguetile (АТСС Р 11974) инокулируют в находящуюся в ферментере питательную среду. Это предварительно простерилизованная в течение 40 мин при температуре 120 С;

40 охлажденная до 28 С водная питательная среда, рй которой поддерживается аммиаком на уровне

6,9 — 7,1, идентичная питательной среде, описанной в примере 1.

Культивируемый в ферментере в тех же условиях температуры рН и продувания воздуха, как в примере 1, микроорганизм обладает 6 — 7-часовой латентной фазой и начинает производить зеаксантин через 14 час от начала культивирования. . Когда содержание глюкоэыв ферментационной

60 среде достигнет, постепенно уменьшаясь, 25 мг/мл, т,е. спустя 24 час после начала культивирования температуру устанавливают на уровне 24 С и в ферментер вводят, предварительно простерилизованный в отдельном сосуде питательный субстрат с рН, регулируемым на уровне 7,2. Состав субстрата аналогичен составу субстрата, описанному в примере 1, Субстрат вводится в ферментер с расчетом на сохранение постоянного уровня содержания глюкозы в среде (25 мг/мл) в течение 20 час, Тем60 пература среды поддерживается на 24 p.

575037

Составитель М. Драншиников

Техред А. Демьянова Корректор П. Макаревич

Редактор л. Герасимова

Заказ 2779(699

Тираж 541 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открчтий

11 035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ГПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Спустя 50 час суммарного культивирования содержание зеаксантина в ферментационной среде определяют хромагрифированием в тонком слое и ультрафиолетовой спектроскопией.

Содержание зеаксантина в ферментационной среде при таких методах измерения 1б мкг/мл.

Для сравнения бактерия культивировалась обычным образом (списанным, также для сравнения в примере 1), Через 55 час от начала культивирования содержание зеаксантина в ферментацнонной среде оказалось равным только 4 ьпсг/мл.

Пример 5. Приготовлен по описанному в примере 2 способу и при тех же самых условиях

lavobacterium agUat11a (АТСС Иа 11947).

Мутант культивировался затем в тех же питательных средах, с постепенным добавлением того же питательного субстрата, как в примере 2, причем в тех же условиях, Спустя 48 час суъвериого культивирования концентрация глюкозы достттгла 5мкг/мл, а содержание зеаксантнна в среде, измеренное аналогично описанному в примере 4, равно 40 мт/мл.

Формула изобретения

1. Способ получения зеаксаитииа нутем культивирования микроорганизма рода НаиоЬастег как продуцента этого пигмента, отличающий ся тем, что, с целью получения пигмента в чистом виде, этот микроорганизм культивируют на питательной среде до стадии роста клеток и образования эеаксантнна, после чего клетки этой культуры выдерживают при температуре 22 — 25 С в!аэробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей не менее 25 — 35 мг/мл углевода к к источника усвояемого углерода н по меньшей мере один источник усвояемого амннного азота, содержащий свободные аминокислоты, при км соответствующие количества этих веществ поддерживают в постоянном соотношении путем постеленного добавления этих

10 веществ в культуралъную среду, и продолжают культивирование до образования в среде достаточного количества межклеточного зеаксантина.

2. Способ но н. 1, о т л и ч а ю.шийся тем, что культнвиро. ание нродуцента ведут в среде

15 рН 6,5 — 8,0.

3. Способ по и. 1, о т л н ч а ю шийся тем, что в качестве углевода берут глюкозу, лактозу нли саха розу.

4, Сиособ ло п. 1, о т.i и ч а ю шийся тем, что источник амннного азота содержит экстракт кукурузы.

5. Способ по и. 1, отличающийся тем, что углевод и источник аминногс азота добавляют в культуральную среду в весовом соотношении

1,6: 3,4 соответственно.

6. Способ но н. 1, отличающийся тем, что клетки с зеаксалтнном выделяют из культуральной среды путем сепарирования.

gp 7. Способ по и. 1 — 6, о т л и ч а ю щ н и с я тем, что зеаксантин выделяют иэ клеток путем экстрагнрования полярным растворителем.