Способ получения антибиотика
Иллюстрации
Показать всеРеферат
ОП ИСАНИ Е
ИЗОБРЕТЕН ИЯ 4 flATÅHTÓ
Союз Советских
Социалистических
Республик (11), 575038 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 08 0175 (21) 2100888/23 — 13 (F1) и. Кл.
С 12 О Р/20 (23) Приоритет— (31) 431845 (32) 09.01.74 (33) США
Гооудоратоенный номнтет
Совете Мнннотроо СССР оо делам неооретеннй н отнрытнй (43) Опубликовано 30.09.77. Бюллетень № 36 (45) Дата опубликования описания 3009.77 (53) УДК
С 15.779.925 (088.8) Иностранцы
Уолтер Даниель Селмер, Фрэнк Кристиан Скиаволиио, Джон Бродерик Роутин и Уолтер Патрик Каллен (США) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма
"Пфайзер ИНК" (СИ1А) (74) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА
Изобретение относится к области микробиологии.
Предлагаемый способ получения антибиотика является новым и в специальной и патентной литературе не описан. Заключается он в том, что штамм Micromonospora lacustris АТСС 21975 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с послвдувлцим выделением антибиотического комплекса и разделением его на компоненты известными приемами.
Микроорганизм, используемый для получения антибиотика, выделен иэ образца почвг близ озера
Роджера, Коннектикут, GIIA. Этот штамм хранятся в Американском институте коллекции типов культур Рокквилл, Мд., под номером АТСС 21975.
Выращивают М, lacustris в водной питательной среде, температура 24 — 36 С, условия аэробные, в погруженном состояли, пря перемешива.яи.
Питательная среда содержит источник усваиваемого углерода, такой как сахара, крахмал, глицерин и меласса, источник органического азота — казеин, ферментативная вытяжка каэеина, мясная мука, пшеничная кыйковина, мука хлопкового семени, соевая мука и мука земляного ореха. В качестве стимуляторов роста мог уг быть использованы дистилляторние дисперсии или дрожжевой экст ракт, а также соли, например, хлорид натрия, ацетат аммония, сульфат аммония, фосфат. натрия и следы минеральных веществ, таких как железо, магний, цинк, кобальт, марганец.
Если во время ферментации происходит избыточное вспенивание, то в ферментационную среду добавляют ан-.ивспениваюшие агенты, например растительные масла нля снликоны. рН ферментапни должно оставаться постоянным, но если ироиыюдит изменение, то к среде добавляют буферный агент (карбонат кальция). Аэрацию среды в резервуарах для выращивания в погруженном состояния поддерживают на уровне 1/2 до 3 объе1а Моа свободного воздуха на 1 объем бульона в минуту. Во время переноса микроор аниэма в течение его роста поддерживают асептические ус. лови я.
Ферментацию ведут от 24 ч до 4 дней. Во время
20 процесса ферментации производят биологические аналиэы бульона с применением ппамма
Staphylococcus aureus.
Смесь антибиотиков анализируют тонкослойной хроматографией. Расщепленне компонентов смеси зависит от содержащихся в ней антибиотик
575038 ков. Малая активность антибиотика не позволяет обнаружить второстепенные компоненты, большая активность — ведет к эффекту торможения с плохим разделением.
Антибиотики, присутствующие в антибиотической смеси, окрашиваются в различные оттенки оранжевого, желтого и розового штетов.
Компоненты смеси извлекают из ферментационного бульона при помощи зкстракции растворителями и хроматографического разделения на колонке, Для экстрагирования антибиотиков из осветленного бульона применяют различные ор. ганические растворители. Эффекптвньтм растворителем является метилизобутилкетон. Экстракцию растворителем проводят, используя объем расгаорителя равный 1/5 объема бульона, из которого извлекают смесь антибиотиков.
Анамицины разделяют и изолируют в восстановленном состоянии, Дпя их восстановления добавляют - 2 г аскорбиновой кислоты нв 1 г смеси антибиотиков в бульон перед фильтрацией и перемешивают 30 мин при комнатной температуре, Сепарацию и извлечение компонентов смеси антибиотиков осуществляют следующим образом.
Осветвленный бульон доводят рН от 4,0 до 4,5 и экстрагируют половиной объема метилизобугилкетона. Кетон удаляют в вакууме и заменяют промышленным этанолом. Раствор зтанола обезжщтивают повторной экстракцией петролейным эфиром. Ансамицины восстанавливают аскорбиновой кислотой, этанол удаляют в вакууме, и остаток подвергают хроматографии на колонке из силикагеля с использованием этилацетата с увеличивающейся концентрацией ацетона в качестве проявляющего растворителя. Фракции с колонки подвергают тонкослойной хроматографии и биоанализу, Активные фракции комбинируют. Основная фракция элюируется и концентрируется.
Антибиотические продукты можно получать при помощи М, lacustris в разбавленной форме, в виде неочищенных концентратов, а также очищенных компонентов. Все они могут быть использованы для борьбы с микроорганизмами, такими как Mu cobecter iu& tuberculosis, 0 р! ососсив
streptococcus, pyogenes и Stephytococcus, включая штаммы, которые устойчивы к другим известным антибиотикам, Их можно применять в качестве дезинфицирующих веществ, для очистки смешанных культур, для медицинской диагностики и биологических исследований.
Антибиотик ".водят животным и людям через рот или парэнтеральным путем для лечения пневмококковых, стрептококковых, туберкулезных и других инфекций, чувствительных к антибиотикам. Дозировка при приеме внутрь через рот
0,5 — 1,0 г в день, при парэнтеральной инъекции
100 — 500мг в зависимости or типа и остроты инфекции и веса.
Он может применяться в виде таблеток, содерг жащих различные наполнители, например, цитрат натрия, карбонат кальция и вторичный фосфат кальция, вместе с дезинтегрирующими веществами, такими как крахмал, альгиновая кислота, и некоторыми комплексными силикатамя и связывающими агентами, например, поливинилпирролидоном, сахарозой, желатином и смолой акации.
Применяют также смазываницие агенты, такие как стеарат магтптя, лаурия сульфат натрия и тальк.
Для введения в рот могут быть использованы
10 водные суспензии или элексиры, в которых основной активный ингредиент комбинируется с различными подслащающими или ароматизирующими агентами, окрашивающим веществом или красиТОЛОМ.
15 Дпя парэнтерального введения изготавливают растворы антибиотика в кунжутном масле или масле земляного ореха.
Пример 1. Готовят стерильную водную ср@ду; имеющую слеДующий состав, г/л:
20 Крахмал 20 0
Ферментативная вытяжка казеина 5,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Декстроза 10,0
25 КгНРО4 0,5
Сасо 4,0
Клетки иэ M. lacustris АТСС 21975 переносят в двухлитровьте колбы Фернбака, каждая из которых содержит 1лсреды,,и встряхивают 8 течение 3 — 4 дней при 28 С.
Около 1% (об,/об.) выращенного инокулума переносят в ферментер с 45000 л стерильной водной среды описанной выше. Поддерживают температуру 30 С, аэрация 1/2 объема воздуха на объем бульона в минуту и перемешивание со скоростью
600об/мин. При вспениЪании добавляют соевое масло для регулирования избьггочного вспенивания. Через 50 — 60 ч 5 — 10% объема этого инояулума переносят в ферментер с 45000 л стерильной.вод40 ной среды вышеописанного состава, но без мясной муки, Температуру поддерживают 30 С, аэрация со скоростью 1/2 объема воздуха на 1 объем жидкой среды в 1мин и перемешивание со скоростью
380 об/мин.
Для . регулирования вспенивания добавляют соевое масло. Сахарозу или декстрозу добавляют через интервалы в 24 ч до уровня — 0,1% вес/объем, Через 90 — 120 ч ферментационньтй бульон фильтруют„и рН доводят до 4,0 — 4,5 в прису:ствии
@ 5 — 10% метилизобутилкетона. Затем бульон экстрагируют 11250 л метилизобутилкетона.Экстракт растворителя концентрируют в вакууме до
1/10 — 1/20 объема, и рН доводят до 5,5 — 6,5 аммиаком или раствором Кг НРО4.
Растворитель (-9 л) удаляют в вакууме и заменяют этанолом. Раствор этанола концентрируют в вакууме до 90л, которые обезжирнвают повторной экстракцией петролейным эфиром, К этанольному раствору добавляют аскорбиновую
60 кислоту (-2 г на 1 r смеси антибиотиков), и раст575038
Формула изобретения
1О
Составитель С Малютина
Техред А. демьянова. Корректор П. Макаревич Редактор .Н. Хубларова
Заказ 2119/699 Тираж 541 Подписное
ЦНИНПИ Государственного комнчета Совета Министров СССР ло делам изобретений и открытий
i13035, Москва, Ж-35, Раушскав наб., д, 4/5
Финна" ППП "Патент", r, Ужгород, ул. Проектнав, 4
5 вор перемешивают при комнатной температуре в течение 30мин. Этанольный раствор концентрируют в вакууме при поддержании рН6 — 7 до жидкого сиропа, который затем берется в хлороформ.
Раствор в хлорерорме концентрируют до сиропа, последний затем хроматографируют на силикагельной колонке и проявляют этилацетатом, со-, держащим увеличивающиеся на 5% количества ацетона. Фракции с колонки подвергают тонкослой6 ной хроматографии и биоанализу и соответственно комбинируют.
Способ получения антибиотика, о т л и ч а ющи и си тем, что штамм Micromonospora lacustris
АТСС21975 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последучицим выделением антибиотиче ского комплекса и разделением его на компоненты известными приемами.