Способ получения антибиотического комплекса а-28086

Способ получения антибиотического комплекса а-28086

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Л Мю ыБ-, Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ (11) Я 13966 (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл. С 12 D 9/00 А61 К 35/74 (22) Заявлено 09.06.75 (21) 2143757/15

10.06.74 (23) Приоритет — (32) 21.04.75

477954 21.№75 (31) 56971 9 (33) США

569740 (43) Опубликовано 15.10.77. Бюллетень № 38

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УЛК 615.779.9 (088.8) (45) Дата опубликования описания 17.11.77 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Дэвид Герберт Берг, Роберт Л. Хамилл, Мэрвир Мартин Хоен и Уолтер Мицуо Накацукаса (США) Иностранная фирма

"Зли Лилли заид Компани" (США) (7 I) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА А-28086

Изобретение относится к способам получения антибиотиков.

Известны способы получения антибиотиков микробиологическим путем, основанные на применении в качестве исходной культуры микроорганизмов вида Streptorhyces aurepfaciens, (11, (21. Антибиотики, продуцируемые данным микроорганизмом, пригодны в качестве антибактериальньтх средств, а также могут применяться в качестве добавки для повышения эффективности потребления корма животными.

Однако в связи с тем, что антибиотики отличаются различной эффективностью в отношении патогенных микроорганизмов, которые к тому же проявляют и стойкость | их действию, поиск новых более эффективных антибиотиков является важной проблемой, Цель изобретения — разработка способа получения комплекса антибиотика А — 28086 и факторов

А, В и 0;этого антибиотика, обладающих антнбактериальн тй, антигрибковой, антивирусной активностью, а также пригодных для использования их в качестве инсектицидных, акарицидных агентов, в особенности пригодных в качестве противокок1шднозного средства, и позволяющих использовать

2 их Лдя увеличения эффективности потребления корма жвачными животными.

Поставленная цель достигается тем, что испож„зуют культуру микроорганизма Streptomyces

aureofaciuns NRRL 5758 илн Streptotnysec aureofa ciens NARL 8092, которую выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода, азота н минеральных солей, с последующим вьщелением из культуральной жидкости целевого продукта. При этом из отделенного комплекса выделяют фракции, содержзщие А, 8: и D факторы данного антибиотика ;

Ь Фактор А антибиотика А - 28086 — кристаллическое соедннение белого цвета, которое растворяется в низших спиртах, диметилформамиде, днметилсульфоксиде, хлороформе, ацетоне и бензоле, но мало растворимо в гексане и нерастворимо в воде; т.пл. 98 — 100 С; точка застывания и точка плавления 195 — 200 С. Это соединение имеет: а) молекулярный вес 764, измеряемый спектрометрически; б) примегный элементарный состав: 66,69% углерода, 9,85% водорода и 23,10% кислорода; в) эмпирическую формулу С4зНт20, „измеряемую масс - спектрометрнческн;

576966

Значение Rf

0,1 1

0,41

3 4

r) удельное вращение — 54, (с - 0,2 метанол), о Относительная определяемое при 25 С; д) ИК - спектр поглощения в хлороформе сс ! следующими максимумами поглощения: 2,85;

3,34; 5,83; 6,84; 7,22; 7,53 (слабый), 5,78 (слабый), 8,76 (сильный), 8,95 (сильный),9,15; 9,50

9 (сильный), 9,55 (сильный), 9,60; 9,85; 10,15; 10,45

1 и 10,70 (слабый) мк;

> е) в его УФ - спектре в этаноле только концевое

1 поглощение ниже 200 ммк;

5,98 ж) спектр ЯМР в дейтерохлороформе со сле- 5,68 дующими характеристиками: б 6,01; 4,21; 4,1); 5,20

3,99; 3,89; 3,80; 3,67; 3,65; 3,57; 3,55; 2,83; 4,98 40

2,76; 2,74; 2,68; 2,66; 2,58, 2,56; 2,30; 2,22; 4,62 40

2,17 2,10 2 05 1,96 1 90 1 85 1 70 1,62; !5 4,21

1 1,60; 1,47; 1,39; 1,31; 1,25; 1,18; 0,95, 0,93; 3,48

0,90; 0,88; 0,85; 0,77; 0,7 5; 0,73; 0,68 и к) Rf = 0,24 при хроматографии в тонком

066 /млн слое на силикагеле в системе растворителя бен3) титруемую группу при величине рКа 7,9 в зол — этилацетат (3:2) с применением Baci I lus

80% - ном водном диметипформамиде; subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживаюшего и) рентгенограмму, полученную методом ди- организма; фракции рентгеновых лучей на образце в порошке л) значение Rfj указанных ниже системах при (Cu - радиация, 1,5405Л, никелевьй фильтр), хроматографии на бумаге с применением Baci I I us имеющую следующиемежплоскостные расстояния1в subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего ангстре уах (0): организма:

Система растворителя

Вода, насыщенная метилизобутилкетоном (МИБК)

Вода, насыщенная МИБК, плюс 2% паратолуолсульфокислоты и 1% пиперидина

0,54 Вода — метанол — ацетон (12;3:1) с добавлением

NHzOH до рН 10,5, затем НэРО4 до рН 7,5

0,48 1% МИБК, 0,5% NH4OH в воде

0,15 17,4 r Кз НРО4, 30 мл этанола на литр воды

0,24 Бензол, насыщенный водой

0,24 Вода

0,75 Вода — МИБК вЂ” этилацетат (98: 1; 1)

577 5,85; 6180; 7,20; 7,50 (слабьй), 7,72 (слам) кислотную функцию, способную образовать

) 868; бый), 7,80 (слабый), 8,57 (сильный), r - 8 90 (сильный), 9,10; 9,50;9,83 (сильньй), 9,90; н) одну по крайней мере гидроксильную груп4О 10,10; 10,17 (сильный), 10,43 (сла ыи, пу, способную к этерификации.

1080 (слабый) 1120 (слабый), 11,35 (слабьй), Изобретение предусматривает также.Сз — 6 -аци и иемлемые соли д) на людаемый

) б ый максимум в этаноле в его УФловые эфиры и физиологически приемле спектре при 220 ммк (E (= 137 5 Е=10,477); этих факторов.

° — - 45 е) спектр ЯМР в дейтерохлороформе со слеIl. Фактор В антибиотика А-28086 — кристаллиУ: Б 720 709 626; дующими характеристиками: ческое соединение белого цвета, когда кристаллизо615; 419; 412; 405; 395; 3 89 3 78 3,62; вано из смеси ацетона и воды, растворимо в низших

3,69; 3,52; 3,48; 2,81; 2,73 263 254 252. спиртах, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, 1,99; 1,91; 1,84; 1,71; 1,6,, 7, 164 155 143 этилацетате, хлороформе, ацетоне и бензоле; но

50 1,33; 1,18; 1,11; 0.96. 0,94; 0,90; 0 87 0 84 мало растворимо в гексане и нерастворимо в воде, 0,77; 0,74и 0,68 /млн ж) величину Ф =0,4- при хроматографии в

Соединение имеет следующие характеристики: б - тилв 53 С то иком слое на силикагеле в смеси енэол - э (3:2) с п именением Baci I I us subt i I is г б молек ля ньй вес 762, определяемый масс- ацетат (: ) с при

АТСС 6633 в качестве обнаруживающего оргаспектрометрией с высоким разрешением; в) эмпирическую ф р у у 43 7 фо м л С Н qO», опреде- низма; е- з) величины в указаннь ляемую масс - спектрометриеи с высоким разрешеRf нных ниже системах при

Вас llоа хроматографии на бумаге с применением ас оа следующими subtilis А1 СС 6633 в качестве обнаруживающего г) ИК - спектр в хлороформе со следую

".. 82; 3 30 ЯО организма: раэличнымк максимумами поглощения:

576966

Значение Rf

0,16

Система растворителя

Вода, насыщенная МИБК, плюс 2 паратолуолсульфокислоты и 1% пиперидина

Вода-метанол-ацетон (12:3:1) с добавлением

NH4OH до рН 10,5, затем Нз РО4 цо рН 7,5

1%МИБК, 0,5% NH40Н в воде

Бензол, насыщенный водой

Вода

Вода — МИБК вЂ” этилацетат (98: ): 1) 0,46

0,36

0,51

0,11

0,61 интенсивность

12,40 100

10,20 70

8,85 90

7,80 30

6,80 10

6,30 100

5,70 20 ,5,35 20

5,10 20

4,90 10

4,65 20

4,45 40

4,20 30

3,30 10

3,15 10

2,99 05

2,77 05

2,28 05 к) значения Rf в указанных ниже системах при хроматографии в тонком слое в силикагене с применением Bacillus subti I is АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма:

Значение Rf Система растворителя

0,26 Бензол — этилацетат (3: 2)

0,66 Этилацетат — диэтиламин (95:5) л) значения Rf в указанных ниже системах при хроматографии на бумаге с применением "Вас Низ.

subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма: тема растворителя метилизобутилкетоном (МИБК) ая МИБК, плюс 2% паратолуолсульфокислоты и 10% пиперидина

Вода — метанол — ацетон (12:3:1) с добавлением

NH4OH до рН 10,5, затем Нэ РО4 до рН 7,5

1% МИБК, 0,5%NHgOH в воде

17,4 r КзНРОз, 30 мл этанола на литр воды

Бензол, шсыщенный водой

Соединение имеет следующие характеристики: а) молекулярный вес 778, определяемыймассспектрометрией высокого разрешения; б) примерный элементарный состав: 67,59% углерода, 9,38% водорода и 22,77% кислорода; в) эмпирическую формулу CqqH>40t 1, определяемую масд. - спектрометрией высокого разрешения; 35

r) удельное вращение — 56 (c = 0,1 метанол), определяемое при 25 С; д) ИК - спектр в хлороформе со следующими максимумами поглощения: 2,89; 3,39; 3,43; 3,50;

5,88; 6,90; 7,25; 7,60; 7,84; 9,00; 9,26; 9,62;

10,31; 10,58; 11,10 и 11,49 мк; е) УФ вЂ” поглощение в 95 o-ном водном этаноле не наблюдается; ж) спектр ЯМР в хлороформе со следующими характеристиками:О 6,00; 4,20; 4,10; 4,00; 3,98;

3,92; 3,86; 3,83; 3,79; 3,67; 3,64; 3,57; 3,54;

2,88; 2,81; 2,71; 2,62; 2,58; 2,48; 2,37; 2,29;

2,21; 2,15; 2,10; 2,04; 1,97; 1,89; 1,83; 1,76;

1,68; 1,61; 1,58; 1,55; 1,47; 1,39; 1,30; 1,25;

1,18; 0,95; 0,90; 0,88; 0,84; 0,74 и 0,68 ч/млн; 50

Значение Rf Сис

0,10 Вода, насыщенная

0,26 Вода, насыщенн

0,36

0,29

0,25

0,26 и) кислотную функцию, способную образовать соли и эфиры; к) две кетогруппы; л) одну по крайней мере гидроксильнун.

Группу.

Предусмотрены и физиологически приемлемые соли этого фактора.

II!. Фактор 0 антибиотика А - 28086 — кристаллическое соединение белого цвета, когда кристаллизовано иэ смеси ацетона и воды, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этилацетате, хлороформе, ацетоне и бенэоле, но только мало растворимое в гексане и нерастворимое в воде; т.пл. 96 — 98 С. з) титруемую группу с величиной рКси 8,67 в 80 о-ном МЬдном диметилформамиде; и) рентгенограмму, полученную методом днфракции рентгеновых лучей на образце в порошке (Cu - радиация, 1,5405Х, никелевый фильтр), имеющую следующие межплоскостные расстояния, в ангстремах (d):

d Относительная

-г:А комплексе может изменяться в зависимости от примененных условий брожения.

Комплекс антибиотика А - 28086 получают при выращивании нового штамма Streptornyces

aureofaciuns NRRL 5758 при брожении в аэробных условиях в толстом слое до достижения значительного уровня антибиотической активности. Этот антибиотик, получают также при выращивании еще г одного нового штамма Streptomyces aureofaciens

NRRL 8092. Полученный! с помощью S, aureofaciens

NRRL 5758 или S.aureofaciens NRRL 8082 анти . биотик экстрагируют из бродил ного бульона и отделяют от мицелия полярными органическими растворителями. Экстрагированную смесь разде- 80 ляют при концентрировании растворов, добавлении к концентрату петролейного эфира для осаждения посторонних примесей с последуюгцим фильтрованием и выпариванием фильтрата до получения смеси антибиотика А - 28086. Эту смесь дополнительно очищают и разделяют на индивидуальные факторы методом хроматографии на колонке.

Содинения А - 28086 замедляют рост организмов, патогенных для животных и растений. Соединения А - 28086 являются агентами, замедляющими

10 рост кокцидий и, кроме того, они являются антибактерн.

BJII IIbIMH, антивирусными„активными против организмов, вызываю них пневмонии, инсектицидными, акарицидными агентами, а также веществами, повьшйющими эффективность использования корма жвачными животными.

Относительная интенсивность

12,00 100

45 10,10

9,25 90

8,00 40

7,50 15

6,92 90

6,40 40

5,98 05

5,60. 15

5,20 40

4,98 40

4,62 40

4,21 20

3,48,10

Удельное вращение фактора Л -. 54 (c. 0,2 ме танол), определяемое прн 25 C. м) кислотную функцию, способную образова:: соли и эфиры; н) по крайней мере одну гидроксильную rpynIIy, способную к зтерификации.

Предусмотрены и C2 — С < - ациловьIe эфиры и физиологически приемлемые соли этого фактора.

Факторы А,В и D антибиотика А - 28086

Я>вые члены группы полиэфирных антибиотиков.

К членам этой гру|шы относятся монензин, цианэмицин (нигерцин) и салиномицин, Термин "антибиотический комплекс" означает смесь совместно; образующихся индивидуальных антибиотических факторов. Отношение индивидуальных получаемых факторов в антибиотическом

На фиг. 1-8 изображены ИК - спектры поглощения в хлороформе.

На фиг. 1 — фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 2 — фактора В антибиотика А - 28086; на фиг; 3 — ацетилового эфира фактора А антибиотика

А. 28086; на фиг. 4 — пропионилового эфира фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 5 — бутириловс

ro эфира фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 6 — валерилового эфира фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 7 — капроилового эфира фактора А антибиотика А - 28086 и на фиг. 8 — ИК-спектр поглощения фактора D антибиотика

А - 28086.

ИБК вЂ” этилацетат (98;1:}}

Факторы А — 28086 структурно похожи пру на друга. Во время брожения совместно образун1тся по крайней мере четыре фактора в виде смеси. Факто. ры отделяют один от другого и факторы А,В и1э выделяют в виде индивидуальных соединений.

Смесь факторов А - 28086 растворима в болыией части органических растворителей, но нерастворима в воде.

Фактор А кристаллизуют из смеси ацетона и воды. Он имеет температуру плавления 98о

100 С, отверждается и снова плавится при

195 — 200 С. Элементарный анализ фактора А дает следующий состав: углерод 66,69%, водород 9,85; и кислород 23,10%. Эмпирическая формула этого фактора С4зНэ О I

Фактор А имеет молекулярный вес приблизительно 764, определяемый масс - спектрометрией.

На фиг. 1 показан ИК - спектр фактора А.

Наблюдались следующие максимумы поглощения: 2,85; 3,34; 5,83; 6,82; 7,22: 7,53 (слабый), 7,78 (слабый), 8,75 (сильный), 8,95 (сильный), 9,15; 9,50 (сильный), 9,55 (сильный), 9,60; 9,85:

10,15; 10,45 и 10,70 (слабый) мк.

УФ - спектр фактора А в этаноле показывает только концевое поглощение ниже 220 ммк.

Спектр ЯМР фактора А в дейтерохлороформе показал следующие характеристики: о 6,01; 4,21;

4,11; 3,99; 3,89; 3,80; 3,67; 3,65; 3,57; 3,55;

2 83; 2 76; 2 74; 2 68; 2 66; 2 58; 2 56; 2 30:

2,22; 2,17; 2,10; 2,05; 1,96; 1,90; 1,85;

1,70; 1,62; 1,60; 1,47; 1,39; 1,31; 1,25; 1,18, 0,95; 0,93; 0,90; 0,88: 0,85; 0,77; 0,75; 0,73; 0,68 и 0,66 ч/млн.

Фактор А, кристаллизованный из смеси ацетона и воды, Имел следующую рентгенограмму, полученную методом дифракции рентгеновых лучей на образце в порошке (Cu = радиация, 1,5405}, никелевый фильтр, d — межнлоскостное расстояние а ангстремах):

576966 интенсивность

12,40 100

10,20 70

40 8,85 90

7,80 30

6,80 10

6,30 100

5,70 20

5,35 20

5,10 20

4,90 10

4,65 20

4,45 40

4,20 30

3,30 10

3,15 10

2,99 05

2,77 05

55 2,28 05 о

Удельное вращение фактора D — 56 (с - 0 1 метанол), определяемое при температуре 25 С

Электрометрнческое титрование фактора в 80%î ном водном диметилформамиде показало при@ сутствие группы с рКа 8,67.

Электрометрическое титрование фактора А в

80% - ном водном растворе диметилформамида показывает присутствие титруемой группы с рК 7,9.

Фактор А растворим в таких органических растворителях, как метанол, этанол, диметилформамид, диметилсульфоксид, этилацетат, хлороформ, ацетон и бензол, но мало растворим в таких ненолярных органических растворителях, как гек".ан, и не растворяется в воде.

Фактор А антибиотика А ° 28086 имеет кислотную функцию, способную к образованию солей и эфиров, а также по крайней мере одну гидроксильную группу, способную этерифицироваться, Фактор В антибиотика А - 28086 — кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды), имеет т.пл, 150 <53 С.

Масс - спектрометрией с высоким разрешением установлено, что фактор В имеет молекулярный вес приблизительно 762 и предполагаемую эмпирическую формулу С43Н7О011 °

На фиг.2 показан ИК - спектр фактора В в хлороформе. Наблюдались следующие максимумы поглощения: 2,82; 3,30; 5,77; 5,85; 6,80; 7,20;

7,50 (слабый) 7,72,(слабый), 7,80 (слабый), 8,67 (сильный), 8,68; 8,90 (сильный), 9,10; 9,50;

9,83 (сильный), 9,90; 10,10; 10,17 (сильный), 10,43 (слабый), 10,80 (слабый), 10,20 (слабый), 11,35 (слабый/, 11,73 (слабый) и 12 03 (слабый) мк

УФ - спектр фактора В в этаноле показывает

ИЬ максимумы поглощения при 220 ммк (Е, 437,5; E=10,477).

Спектр ЯМР фактора В в дейтерохлороформе показал следующие характеристики: Ь 7,20; 7,09;

626; 615; 419; 412; 405; 395; 389; 378;

3,62; 3,59; 3,52; 3,48; 2,81; 2,73; 2,63; 2,54;

2,52; 1,99; 1,91; 1,84; 1,71; 1,64; 1,55; 1,43;

1,33; 1,18; 1,11; 0,96; 0,94; 0,90; 0,87; 0,77; 0,74 и 0,68 ч/млн.

Фактор В антибиотика А - 28086 растворим в таких органических растворителях, как, например, метанол, этанол, диметилформамид, диметилсульфоксид, этилацетат, хлороформ, ацетон и бензол; мало растворим в неполярных растворителях, например в гексане, и непастворим в воде.

Хотя химическая структура фактора В не выяснена, однако физические и химические свойства показывают, что фактор В имеет одну группу карбоновой кислоты, две кетонные группы и одну или более гидроксильных групп.

При получении с помощью S. aureofaciens

NRRL 8092 фактор D составляет до 1№ вьщеленной антиэиотической акгивности; при получении с помощью S. aureofaciens NRRL 5758 он является наименьшим sa факторов..

Фактор D антибиотика А - 28086 — кристаллический продук1 белого цвета (при кристаллизации о из смеси воль и ацетона) с т.пл. 96 — 98 С, Кажуцвгйся молекулнрц эй вес 778 (Определяется массспектрометрией с высоким разрешением) . Элементарный состав пика в масс-спектре натриеной соли фактора 0 800,5050 (вычислено для

C44H730i i 800,5050). В масс ° спектре фактора р

5 в форме свободной кислоты наблюдали небольшой максимум при 778 и больший максимум при 760, 5117 (вычислено для C44H730i р 760,5125); м/э 760 в масс - спектре свободной кислоты Hsляется результатом потери воды иэ молекулярного

l0 иона. Поэтому состав молекулярного иона фактора D в форме свобОдной кислоты C44H740i 1.

Предполагаемая эмпирическая формула фактора D C44H740i . Элементарный анализ фактора D дал следующий состав: 67,59% углерода, 9% во15 дорода и 22,77% кислорода.

Теоретически для С44Н740< 1 требуется 67,87% углерода, 9,51% водорода и 22,77% кислорода.

Фактор D в 95% - ном водном этаноле не

20 поглощает УФ - лучей.

Спектр ЯМР фактора D в дейтерохлороформе имеет следующие характеристики: Б 6,00; 4,20;

4,10; 4,00; 3,98; 3,92; 3,86; 3,83; 3,79; 3,67;

3,64; 3,57; 3,54; 2,88; 2,91; 2,71; 2,62; 2,58;

25 2,48; 2,43; 2,37; 2,29; 2,21", 2,15; 2,10; 2,04;

1,97; 1,89; 1,83; 1,76; 1,68; 1,61; 1,58; 1,55;

1,47; 1,39; 1,30; 1,25; 1,18; 0,95; 0,90; 0,88;

0,84; 0,74 и 0,68 ч/млн.

Фактор О, кристаллизованньш иэ смеси ацетона и воды, имеет следующую рентгенограмму, полученную методом дифракцип рентгеновых лучей на Образце в порошке (СО" - радиация, 1,5405, никелевый фильтр), d — межплоскостнае расстояние в ангстремах:

35 Относительная! 6966

=:уго образовать соли и эфиры и по краилей мере

4п у гидроксильную группу, способную зтерифици рова ться.

Значения Rf факторов А, В и D в разных систе5 мах хроматографии на бумаге с применением

Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма, показаны ниже.

Фактор D растворим в таких орган;.ч "..-.,:х . ":ворителях, как метанол, этанол, диметкл р;";a:..: .д, Лиметилсульфоксид, этилацетат, хлороформ, апетo» и бензол; мало растворим в таких неполярных органических растворителях, как, например, гексан, и нерастворим в воде.

Фактор D имеет кислотную функцию, способВеличина Rf

М фактор А фактор В Фактор D

0 11 009 010 В

Система растворителя ода, насьпценная метилизобутилкетоном (МИБК)

Вода, насыщенная МИБК, плюс 2% паратолуолсульфокислоты и 1% пиперидина

Вода — метанол-ацетон (12:3:1) при добавлении

MH4ÎH установлено, а затем снижено до рН 7,5 НзРО4.

1% МИБК, 0,5% NH4OH в воде

17,4 г КзНРО4, 30 мл этанола в литре воды

Бензол, насышенный водой

Вода

Вода — МИБК вЂ” этилацетат (98:1:1) .

0,26

0,16

0,41

0,36

0,46

0,54

0,39

0,25

0,36

0,33

0,48

0,15

0,24

0,09

0,64

0,51

0,11

0,61

0,24

0,24

0,75

Величины Rf для факторов А, В и D в двух E.Мерк, Дармштат Г - 254, толщина слоя 0,25 см) системах при хроматографии в тонком слое на э5 прицрименении В. subtilis АТСС 6633 в качестве силикагеле (предварительно покрытые пластины обнаруживающего организма следующие.

Величина Rf

Фактор А фактор:В фактор D Система растворителя

0,24 0,42 0,26 Бензол-этилацетат (3: 2)

0,54 0,34 0,66 Этилацетат-диэтиламин (95: 5)

Одновременно с комплексом антибиотика образовывать соли "Физиологически приемлемыми"

A-28086 образуется другое вещество, произволь- солями, которые приемлемы также как фармацевно названное А — 28086 — 1. Это вещество, не актив- тические средства, являются соли, у которых токное микробиологически, структурно родственно сичность в отношении теплокровных животных не превышает токсичности несолевой формы соедиА -28086 - 1 — кристаллическое соединение пений. Пригодными солями факторов А и В явбелого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона ляются соли натрия, калия, лития, цезия, рубидия, и воды) имеет т,пл. 160 — 162 С. Сравнительное ис- бария, кальция и магния. следование спектров ЯМР и других свойств А- К пригодным аминовым солям факторов А и В

-28086 - 1 и синтетически приготовленного метило- относятся соли аммония, первичного, вторичного н вого эфира фактора А доказывают, что А - 28086 - третичного С1 — С4 - алкиламмония и окси - С вЂ” C4

-1 представляет собой метиловый эфир фактора А - алкиламмония. или очень близкое соединение, т.е. стереоизомер. Соли щелочных и щелочноземельных металлов

Хотя А - 28086 - 1 осаждается совместно с факторов А, Ви D, также ациловые эфиры фактоактивными факторами антибиотика А - 28086, 45 ров А и D получают обычными способами приготоводнако он легко отделяется хроматографией на ления солей. Например, фактор в форме свободной силикагеле. А - 28086 - 1 имеет величину Rf, кислоты или эфира растворяют в подходящем растравную примерно 0,53 при хроматографии в тон- ворителе,напримертепломметанолеилиэтаноле, и ком слое на силикагеле с этилацетатом в качестве к раствору добавляют раствор, содержащий стеэлюента и при применении ви нии винилового реагента для хиометрическое количество неорганического осноопрыскивания (3% ванилина в метаноле плюс вания в водном метаноле, Полученную соль можно

0,5 мл концентрированной серной кислоты на выделить обычными способами, например фильтро100мл раствора) с целью обнаружения. После оп- ванием или выпариванием растворителя, рыскивания винилином и нагревания А - 28086 - 1

55 Таким же способом можно получать соли с дает синее пятно, в то время как факторы антибиотика А - 28086 дают яркие розовые пятна, органическими аминами. Например, газообразный которые быстро становятся темными, коричневато- или жидкий амин можно добавить к раствору синими. фактора в подходящем растворителе, например

Факторы А, В и D, а также указанные эфиры ацетоне, а затем выпарить растворитель и избыток карбоновой кислоты и факторов А и 0 способйы + амина. Формулу соли можно выбирать в зависи 769 6

7,60 (слабый), 7,80 (сильньй), 8,45 (сильный) 8,80. (сильный), 8,9 5 (сильньй), 9,10 (сильньй), 8 20; 9,63, 55

13 мости от удобства применения, токсичносги и эр:ономии.

Фактор А образует эфиры карбоновых кислот.

Этерификация происходит у одной из гидроксильных групп фактора А при обработке ангидридом или хлорангидридом С,--С, ° кислоты. Такие эфиры обычно получают при реакции фактора А с соответствующим ангидридом кислоты при комнатной температуре, Такие эфиры также пригодны в качестве антибиотиков и агентов, повышающих эффективность использования корма.

Ацетиловый эфир фактора А — кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды) имеет т.пл, 100 — 103" С и эмпирическую формулу С„, Н„дО, z. Молекулярньй вес его равен примерно 807 в соответствии с эмпирической формулой, предложенной для фактора А, Элементарный анализ ацетилового эфира фактора А дает следующий процентный состав:

Вычислено,% С 66,97; Н 9,24; О 23,79.

С4вН О г

Найдено,%: С 67,67; Н 8,71; 0 23,13.

ИК - спектр ацетилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 3. Наблюдались следующие максимумы поглощения: 2,85; 3,36;

3,38 (сильньй), 5,80; 6,83; q 7,25 (сильный), 9,80 (сильньй), 10,12 (слабьй) и 10,50 мк.

УФ - спектр (фактора А ацетилового эфира) в этаноле показывает только концевое поглощение.

Электрометрическое титроваиие ацетилового эфира фактора А в 80% - ном водном диметилформамиде показывает присутствие титруемой группы с рКа 8,5.

Пропиониловый эфир фактора А — кристаллическое вещество белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды) с т.пл. около 96 — 98 С.

Пропиониловьй эфир фактора А имеет эмпирическую формулу C< H sO> г и молекулярный вес около 821, вычисленный по эмпирической формуле, предложенной для фактора А.

Элементарньй анализ пропионилового эфира фактора А дал следующий процентный состав.

Вычислено,%: С 67,29; Н 9,33; О 23,38

С4ьН76011

Найдено,%: С 66,06; Н 9,17; 0 23,41.

ИК - спектр пропионилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 4. Наблюдались следующие максимумы поглощения. 2,85; 3,33;

3,38 (сильный), 3,45 (сильньй), 5,75 (силыьй), 5,82; 6,81; 7,22; 7,30 (сильный), 7,50 (слабьй), 7,60 (слабый), 7,80; 8,43; 8,75 (сильный), 8,90;

9,05; 9,15 (сильньй), 9,50 (сильный), 9,63;

9,83 (слабый), 10,05 (сильньй), 10,13; 10,20 (сильный); 10,45 и 10,68 мк.

УФ - спектр пропионинового эфира фактора А в э1аноне показан только концевое поглощение.

Бутприновый эфир фактора А - криетанни10

50 ческое соединение белого цвета (при кристаллизации иэ смеси ацетона н воды) с T.ïë. < кало 96 — 98 С. Этот эфир имеет эмпирическую формулу C47H7 $0) J монекулярньй вес около 835 и примерный состав: С 67,607., Н 9,41%, О 22.99%, вычисленный по эмпирической формуле фактора А.

ИК - спектр бутирилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 5. Максимумы поглощения следующие: 2,89; 3,40; 3 45; 3 51; 5,85;

5,92 (сильный), 5,97 (сильный), 6,90; 7.30;

7,84 (слабый), 8.55; 8,85 (слабый), 9,01 (сильный), 9,26; 9,76; 9,95; 10,31 и 10,64 мк.

Валериловьй эфир из фактор - А и валериановой кислоты — кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды) с т.пл. около 173 — 175 С имеет эмпирическую формулу С4аНаеО, молекулярный вес около 849 и примерньй состав: С 67,89%; Н 9,50%;

О 22,61%, как вычислено по предложенной эмпирической формуле фактора А антибиотика А - 28086.

ИК - спектр валерилового эфира фактора А в хлороформе показан на фнг. 6. Максимумы поглощения следующие: 2,90; 3,40; 3,45; 3,51; 5,87;

5,92 (сильньй), 5,99 (сильный), 6,81; 7,30; 7,69 (слабый),7,87 (слабьй), 8,16, 8,58; 8,85 (слабьпю),9,26;

9,76; 10,00 (слабый), 10,31 и 10,64 мк.

Эфир капроновой кислоты и фактора А, капроиловый эфир — кристаллическое соединение белого цвета (цри кристаллизации нз смеси ацетона и войты) с т.пл. около 163 — 167 С имеет эмпиричес. кую формулу С4 На,О, „молекулярный вес около 863 и примерньй состав: С 68,18%; Н 9,58%;

О 22,24%, определенньп по эмпирической формуле фактора А.

ИК - спектр капроилового фактора А показан на фиг. 7. Максимумы поглощения: 2,90; 3,40;

3,45; 3,51; 5,87; 5,92 (сильный), 5,97 (снльный), 6,90; 7,30; 7,66 (слабый), 7,84 (слабый), 8,16;

8,58; 8,85 (слабый), 9,05 (сильный), 9,17; 9,72;

9,96; 10,29 и 10,62 мк.

ИК - спектр фактора 0 (фиг. 8) имеет следующие максимумы поглощения 2,89; 3,39; 3,43;

3,50; 5,88; 6,90; 7,27; 7,60; 7,84; 9,00; 9,26; 9,62;

10,31; 10,57; 11,10è 11,49мк.

В результате ацилирования фактора А происходят следующие изменения спектра I ядерного магнитного резонанса: карбонильный резонанс, происходящий примерно при 4 ч/млн, перемешается примерно до 5,3 ч/млн (точное положение немного изменяется в разных ацнлпроизводных); смешаются также сигналы вининпротона. Эти характерные изменения представлены в частичной структуре:

H R

0Н СО 11

}1 11 RCOX

Н Н

О где R представляет С,--C, - анкил.

Эти частичные ст уктургн полностью еоответс1вуют экепернмен1ал1 но:1„ I омол1олекулярномч

/69ьь

1SPP3 (овсяная мука) ISPP4 (неорганическая соль — крахмальньй агар) $РP 5 (глицерин — аспарагиновый агар) Томатная паста — агар с овсяной мукой

Глицерин — глициновый агар

Пищевой агар разъединению и ЯМР - спектру 13 зф::-;".= у. у и пропионовой киаяот.

Ст — Сь - ацияаеыи эфир фактора А растворим в таких органических растворктелях, как метанол, этанол, диметияформамид, диметилсульфоксид, этилацетат,1хлороформ, ацетон и бенэол, но мало растворим в (неиояярных органических растворителях, например в гексане, и нерастворим в воде.

Каждый C> — Ce - ацеловый эфир антибиотика А28086 имеет кислотную функцию, способную образовывать соли и эфиры.

Новые антибиотики получают при выращивании штамма Streptornycer aureofaciens, обраэуинцего А- 28086 в.аэробных условиях глубинным способом в подходящей питательной среде до образования значительной антибиотической активности. Антибиотики выделяют, используя разные, обычно применяемые способы выделения и очисткц.

Характеристика 1чЯВ1 5758 в разных средах.

Среда ЯРЦ 2 (дрожжевой экстракт— солодовый экстракт) Глюкоза ° аспарагинов ый агар

Один из организмов, пригодных для приготовления антибиотиков А - 28086, был выделен из образца почвы, собранной на Арарате„Тур|шя. Этот организм классифицирован как штамм Streptnmy.

ces aureofaciens Луггара.

Культуры выращивали при 30 С в течении

14 дней, кроме особо отмеченных случаев, Характеристика штамма МНЯ1 5758, образующего А - 28086.

1Î Морфология

Гифы, образующие споры, состоят из блоков, петель и открытых спиралей. Наблюдался также морфологический представитель типа ректис эластичный. Споры короткие и цилиндрические, 16 образуют, цепи из 10 — 50 спор. Размер снор

1,3 х 1,75//в пределах от 1,3 до 1,96 х 1,3 р. Поверхность спор, наблюдаемая с помощью электронногс микроскопа, гладкая.

Характеристика

Обильньй рост; обратная сторона желтая; воздушный мицелий и спорообразование от удовлетворительного до хорошего; мицелий белый (w) 13 Ьа и темно - серый (Gy), 3ih; нерастворимьй пигмент.

Рост хороший; обратная сторона зеленовато>келтая (11В2); удовлетворительный воздушный мицелий (бу) темно-зеленый, 3ih; растворимый пигмент светло - коричневый.

Обильньй рост: обратная сторона светлая желтовато - коричневая (12ES); воздушный мицелий и споры (w) пурпурные и белые

13 Ьа до (Gy) светло - серых нерастворимый пигмент.

Рост хороший; обратная сторона светлая, желтовато - зеленая; хорошие воздушный мицелий и споры (Gy) желтовато - серые

2dc до светлых серовато - красновато-коричневых 5Фе; нерастворимьй пигмент.

Обильный рост; обратная сторона светлая, желтовато - коричневая (13Н7), воздушный мицелий и споры от удовлетворительных до хороших (w), от белого А до (G y) средне - серого g. Растворимый пигмент светло - коричневый.

Обильный рост; обратная сторона темная серовато - желтая (1216); хорошие воздушный мицелий и споры (У), светло - желтые 24Ь нерастворимый пигмент.

Обильньй рост; обратная сторона серовато-зеленовато - желтая (12Е2) обилие воздушного мнцелия и спор (Gy) желтовато - серого цвета 2dc; светльй коричневый растворимьй пигмент.

Рост хороший, обратная сторона сероватожелтая (12В2), цвет воздушного мицелия и спор не определен ввиду плохого развития; нерастворимьй пигмент.

576966

18

Обильный рост; обратная сторона сероватожелтая (12КЗ); скудные воздушный мицелий и споры (Gy) желтовато - серый 2dc; нерастворимый пигмент.

Хороший рост; обратная сторона сероватокоричневая (15C8); нет воздушного мицелия и спорообразования; коричневый растворимый пигмент.

Рост хороший, цвет не определен ввиду плохого развития.

Обильный рост; обратная сторона серовато - желтая (11,5), нет воздушного мицелия или спор; нерастворимый пигмент.

Обильный рост; обратная сторона светлая, сливково - коричневая (14,5) обильные возду ш ый мицелнй и споры от (w) Ь (центр) до (GV) светлых коричневато-серых

3fe (по краям); очень светло - коричневый растворимый пигмент.

Слабый рост; цвет не определен.

Агар с кальциевой солью яблочной кислоты

Агар с раствором Чапека

Агар Эмерсона

Тироэиновый агар

Триптоново - дрожжевой агар

Организм NRRL 5758 был исследован с целью определения некоторых физиологических свойств стандартным способом.

Свойства

Действие на молоко

Отрицательная

Отрицательная

Хороший рост при 26 — 30 С; отличный рост и спорообразование при 37 С; слабый вегетативный рост при 45 С; красноватый растворимый пигмент.

0- манчит

Изоинозитол +

Рамноза +

Рафиноза

Контроль, без углевода

Второй новый организм, образующий А - 28086, был получен из S. aureofaciens NRRL 5758 путем селекционирования, сопровождаемого химической мутацией. Этот организм, идентифицированный как

NRRL 8092, и классифицирован как разновидность

Streptornyces aureofaciens Дуггара. Эта классификация была основана на результатах исследования организма NRRL 8092 ранее описанными методами классификации Streptomices в таких же условиях оста.

Нитратное восстановление

Пищевой желатин

Образование меланинового пигмента на косом агаре с тирозином пептон Дифко — дрожжевом экстракте — железо — косом агаре на бульоне с триптоном и экстрактом

Необходимая температура ISP среда P2 - косая среда из дрожжевого и солодового экстрактов

Результаты опытов по определению утилизации углерода, проводимых с организмом NRRL 5758, следующие. Для характеристики роста применены следующие обозначения:

+ хороший рост положительное использование углерода; (+) рост от плохого до удовлетворительного; (— ) слабый рост, вероятно, беэ утилизации — нет роста, нет утилизации, Источник углерода Реакция

0 - глюкоза +

L - арабиноза

О - ксилоза +

О - фруктоза

Сахароза

Характеристики

Молоко пептонизировалось, белое кольцо; прозрачная область рыжевато- коричневая, рН 5,7.

Положительное

Разжижение на 30 o через 14 дней

Очень слабо положительная (пигмент через

4 дня) 576966

19

Характеристика штамма 1чйй1 8092, образующего А - 28086 1

Морфология

В шпательной среде TSP - P7 (агар с тирозином) культура образует редкие крючки, но главным ооразом короткие и прямые спороформы, Цепи аюр состоит из не менее 10 спор, обычно иэ 4 — 7 спор

Короткие прямые цепи спор наблюдыйкь в следуюХарактернстика 1чЯЯ(8092 в разных средах щих средах: 1$Р113 в агаре с раствором Чапека и

SPP5. Обильная коремня наблюдалась в агаре

Эмерсона. Наблюдения с помощью электронного микроскопа производили на агаре с тирозином (ISPP7) и на arape с глюкозой и асларагином.

Споры были гладкие длиной от 1,2 до 2,0 и диаметром около 1,0 мк. Средний размер пор

1,6 к 1,0 мк .

1$Р112 (дрожжевой и солодовый экстракты)

1$РДЗ (овсяная мука)

ISPP4 (агар с неорганическими солями и крахмалом)

ISPP5 (агар с гшщерином и аспарагином)

Агар с томатной пастой и овсяной мукой

Агар с глицерином и глицином

Агар с глюкозой и аспарагином

Пищевой агар

Агар Беннета

Агар с малеиновокислым кальцием

Агар с раствором

Чапека

Агар Эмерсона

Агар с тирозином

Характеристика

Рост удовлетворительный; обратная сторона светлая, желтовато - коричневая (12Н8); удовлетворительный воздушный мицелий; плохое спорообразование; мицелий светло - серый; нерастворимый пигмент.

Рост разбросанный; обратная сторона прозрачная; нет воздушного мицелия; нерастворимый пигмент.

Рост умеренный; обратная сторона сероватожелтая (11В2); скудный воздушный мицелий и плохое спорообразование; воздушный мицелий светльй, желтовато - серый; (10А1); нерастворимый пигмент.

Рост умеренный; обратная сторона светло - желтая (10P2); удовлетворчтельный воздушный мицелий; скудное спорообразование; мицелий белый (10A1); нерастворимый пигмент.

Рост умеренный; обратная сторона сероватая зеленовато - желтая; воздушный мицелий удовлетворительный; средняя степень спорообразования: бледно - серая (55A2); нерастворимый пигме п.

Обильный рост; обратная сторона серовато - желтая (11Е4); умеренный воздушный мицелий, белый (lOA1); спорообразование не происходит; нерастворимый пигмент.

Рост умеренный; обратная сторона светло - желтая (lOF2): умеренный воздушный мицелий н такое же спорообразование, белый (10A1) мнцелнй; нерастворимый пигмент, Рост скудный, обратная сторона светло - желтая (10В2); нет воздушного мицелия; нерастворимый пигмент.

Рост удовлетворительный; обратная сторона среды желтовато - пунцовая; очень скудный воздушный мицелий; спорообразование не происходит; нерастворимый пигме, т.

Рост очень скудный, просвечивающийся; нет воздушв ого мицелия; нерастворимый пигмент.

Рост очень скудный; обратная сторона прозрачная; нет мицелия; нерастворимый пигмент.

Рост умеренный; обратная сторона серовато - желтая (1115); пятнистый воздушный мицелий; спорообразования не происходит; нерастворимый пигмент, Рост умеренный; обратная сторона светлая желтовато - коричневая (12Н6); умеренный воздушный мицелий, светлый слабо - серый край (53A2): центр почти белый; спорообразование

576966

2l 22 умеренное; нерастворимый пигмент.

Рост очень скудный, просвечивающийся; нет воздушного мицелия; нерастворимый пигмент.

Фалиологические срок;ва.организма N R Щ 8092

Агар с триптоиом и дрожжами

Характеристики

Свойства действие ыв молоко

Очень слабо положите щи

Результаты опытов по определению утилизации углерода приведены ниже. Для указания степени роста использованы следуницие обозначения.

+; положительная утилизация; . (+) рост от плохого до удовлетворительного; (-) слабый рост, вероятно, без утилизации, * an роста, иет утилизации. Источник углерода Результат

D глюкоза + с - арабиноэа +

NRRL 5758 и ор

Признаки

Веге тативиый

NRRL 5758

NRRC 8092

От кремового до светло - желтого цвета на нескольких средах.

Короткие прямые спорофоры и случайные крючки

Желтый на нескольких средах

Спиральные спорофоры на среде из пасты томатной и овсяной муки; и на среде: неорганические соликрахмал

Ро