Способ получения вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

Способ получения вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

з - 1 н т > ;:ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПИ АНИ

Союз Советских

Социалистических

Васпублик (11) 576968

К ПА е ЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 20.12.71 (gl ) 1726052/16 (23) Приоритет — (32) (51) М. Кл С 12К 5/00

1ааударственный намнтет

Совета Министров СССР по делам нэоаретеннй н открытий (3! ) (33) (43) Опубликовано 15,10.77. Бюллетень № 38 (53) УЙК 576.8.094 (088.8) (45) Дата опубликования описания 18.11.77 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Фрэнк Джерри Воленес и Джюдсон Дональд Тодд (США) Иностранная фирма

"Ричардсон Меррел Инк." (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии.

Известен способ получения вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота путем культивирования вируса в культуре клеток почек свиней. Однако известный способ обеспечивает недостаточно высокую специфическую активность препарата.

С целью повышения, специфической активности препарата вирус не менее 40 раз пассируют в культуре клеток крупного рогатого скота, а затем не менее 23 раз пассируют в культуре клеток почек кролика, .

Вакцина, пполучаетКая предложенным, способом, содержит, живой вирус:нйфекцйониого бычьего ринотрахента (ИБР), ыиовый виддизмейен и ослаблен. несколькимн посдед<эвательньтмн. пассажайи .и культуре ткани цочки- кролика -до такой степени; что может быть использован для прививки йротив инфекции ИБР путем внутринвсовой вакцинации.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Приготавливают культуру клеток почки зародыша быка. У трех шестимесячных зародышей здоровых коров почки стерильно удаляют и обопочку почки и жировой слой почки измельчают.

Полученные кусочки подвергают действию раствора

25% трипсина в растворе основной соли Ерла при

37 С и постоянном перемешивании до тех пор, пока клетчатка не Лиспергируется. Эту суспензию центрифугируют при 4 С в течение 10 мин со скоростью

1000об/мин и всплывающий слой отбрасывают.

Осевшие клетки суспенднруют повторно до концентрации конечного объема 1:200 в среде роста, 1 содержащей следующие компоненты,% :

Раствор равновесной соли Ерла 80

Гищюлизат лактальбумнна, 5 o- ный (вес/объем)

15 водный раствор

Фильтрованная бычья сыворотка 10

Полимиксин В 100 ед/мл

Сульфат неомицина 100 мкг/мг

Амфотерицин Б 1 мкг/мл 500 мл этой суспензни добавляют в несколько бутылок с культурой ткани. Эти бутылки выдерживают в термостате при 37 С до тех пор, пока сливающийся монослой не покроет донную поверхность (4-6дней). Среду роста затем удаляют и

576968

8000,0

400,0

1000,0

580,0

500,0

200,0

Бутылки выдерживают в термостате при 37 С в течение 30 мин, при этом клетки отделяются от поверхности стекла и диспергируются. Клеточную 60 заменяют с сохранением среды следующим составом,. %:

Pacrsop равновесной соли Ерла 88

Гидролизат лактальбумииа, 5

5 o-ный (вес/объем) водный раствор 10

Фильтрованная бычья сыворотка 2

ПЬлимиксин Б 100 ед/мл

Сульфат неомицинв 100 мкг/мл

Амфотерицин Б 1 мкг/мл

Каждую из бутылок затем заражают раствором с концентрацией от 1:80 до 1:500,размноженного выращиванием в ткани почки быка вируса ИБР и 15 выдерживают в термостате 3-5 дней. Этот процесс повторяют 13 раз.

Почки удаляют из четырех-шестинедельных новозелацдских кроликов. Оболочку и жировой слой почки мелко рубят в стерильных условиях на 20 кусочки, которые помещают в раствор, содержащий 0,25% трипсина в растворе равновесной соли

Ерла. ту смесь выдерживают в термостате при постоянном перемешиваиии при 37 С до тех пор, пока клетки ие диспергируют. Клеточную суспен- 25 зию затем цеитрифугируют ири 4 С в течение

10 мии on скоростью 1000 об/мии и всплывающий слой удаляют. Осейиже кяежи сумендируют повторно при объемной концентрации 1:200 в среде роста почки кролика (ПК), содержащей следующие 30 компонент, % .:

Минимальная существенная среда Ерла 80

Гидролизат лактальбумина, 5-ный (вес/объем)

35 водный раствор 10

Эмбриональная бычья сыворотка 10

Пенициллин 100 ед/мл

Сульфат стрептомнцнна 100 мкг/мл 10

Амфотернцнн Б 1 мкг/мл

Эмбриональная бычья сыворотка инактивирована теплом прн 56 С в течение 1 час и стерилиэована фильтрацией через фильтр иэ мембраны 220 нм.

300 мл суспензии клеток добавляют в каждую бу- 45 тылку с культурой ткани (Повитского), затем бутылки выдерживают в термостате при 37 С 5-6 дней, В это время среду роста удаляют н заменяют 50 мл раствора, состоящего иэ следующих компонентов, мг/л: 50

NaCF

КС1 .

Декстроза йзНСОэ

Трипсин (1:250). 55

ЕДТА суспенэию затем центрифугируют при 4 С в течение

10 мин со скоростью 1000 об/мин и всплывающий слой удаляют. Осевшие клетки повторно суспендируют в среде роста почки кролика (как упомина лось вьши) при объемной концентрации 1;400.

150 мл этой суспензии добавляют в несколько однолитровых бутылок с культурой ткани, которые выдерживают в термостате при 37 С на вращающемся барабане, обеспечивающем один оборот каждые две минутьь Выдерживают в термостате до тех пор, пока образуются монослои клеток (2-3 дня). В это время среду роста удаляют и заменяют средой отстоя, состоящей из следующих компонентов: раствор равновесной соли Ерла с 0,5% гидролиэата лактальбумина и 2% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл сульфата стрептомицина иа 1 мкг/мл амфотерицина Б.

Вирусный прививочныи материал затем добавляют при раэбавлении 1:100 к среде отстоя во вращакнцихся бутылках для заражения клеток.

Первую вращающуюся бутылку с клетками почки кролика инокулируют 54- м пассажем вируса

ИБР на культуре клетки почки быка, Объем прнвивочного материала составляет 1,0 мл, содержит приблизительно 1010 медиана зараженных частиц культуры ткани на 1 мл. Выход вируса иэ этого прививочного материала снимают через два дня, Время снятия определяют для этого пассажа и для всех соответствующих пассажей посредством продления цитопатического эффекта, наблюдаемого в клетках монослоя из почки кролика. Снятие урожая осуществляют через 48-72 час после инокуляцин для всех успешных пассажей, кроме пассажей 19 и 20. Эти два пассажа сняты приблизительно через 30 час после инокуляции. Нет значительной разницы в выходе вируса, полученного через 30,48 или 72 час после инокуляции, обеспечивающей вышеописанные критерии для оценки цнтопатического эффекта.

Пассажи 1 - 4 (ПК-1 — ПК-4) переносят последовательно, материал, снятый с предшес. ующего пассажа, инокулнрованного непосредственно во вращающуюся бутылку с клетками почки кролика для следующего пассажа. Объем прививочного ма. териала постоянный для каждого пассажа — 5,0 мл.

Материал снятого вируса от ПК-4 пассажа эамораживают при — 65 С после того, как его распределяют в стеклянные пузырьки объемом 4,0мл н плотно закупоривают, Материал сохраняетсл в замороженном состоянии 60 дней, после чего оттаивают и используют как прививочный материал для

ПК-5. Последовательные пассажи от ПК-5 до ПК-17 осуществляют, как описана выше, для ПК-1, ПК-4 пассажей, Вирус пассажа ПК-17 замораживают, как упоминалось выше, и сохраняют в течение 7 недель, затем оттаивают н инокулируют в культуру клеток

ПК во вращающейся бутылке для образования

ПК-18 пассажа, Пассаж ПК-18 снимают и замораживают, как описывалось выше.

576968

Способ получения вакцины проп1в инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота путем

8р культивирования вируса на культуре клеток, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения специф ической активности препарата, вирус не менее 40 раз пассируют в культуре клеток крупного рогатого скота, а затем не менее 23 раз пассируют в культуре

85 клеток почек кролика.

Составитель Г. Малютина

Техред Н. Андрейяук

Корректор А. Власенко

Редактор Е. Хори на

Заказ 2960/704

Тираж 541 Подлисное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров C(СР ло делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж--35, Раушская наб., a. 4/5

Филиал ППП "11атент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Из суспензии ПК-16 пассажа вируса приготовляют последовательные 10-кратные разбавления от (-т) «-8)

log 10 до log 10, Одну десяткою миллилитра каждого разбавления от log 10, до log 11У, инокулируют в каждую из десяти 16я1 50 мм стеклянных трубок с культурой ткани, содержащих монослой клеток ПК, приготовленный,как описано для культивирования клеток во вращающихся бутылках, кроме этого, трубки выдерживают в термостате в стационарных стеллажах под углом 5 к горизонтали. Инокулированные трубки выдерживают в термостате при 37 С в течение 6 дней. После этого из одной трубки, которая показывает характерные цитопатические изменения клеток при наивысшем разбавлении log 10, а также из других трубок

C-51 собирают жидкость, разбавляют последовательно

„. сятикратно, как описано выше.

Каждое разбавление от log 10 до log 10 (-4) инокулирована в 1/10мл объеме в каждую из десяти 16я150 мм трубок, содержащих монослой клетки ПК. Вирус из одной трубки (при 10 ) выделяют, это клон конечного разбавления N 1, который соответствует вирусу пассажа ПК-19. Процедуру конечного разбавления повторяют последовательно три раза, Вирус Р2 клона конечного 2ч разбавления собирают через пять дней инкубации после инокуляции, он соответствует вирусу ИБР пассажа ПК-20. Процесс повторяют, выделившийся вирус N 3 клона конечного разбавления соответствует вирусу пассажа ПК-21.

Вирус пассажа ПК-21 инокулируют в объеме

1,0 мл в полистироловую колбу, содержащую монослой ПК клеток, приготовленных, как описано выше. Донная поверхность колбы составляет

75 см, объем среды, содержащей культуру ткани, равен 30 мл. Выделенный иэ этой инокуляции вирус через 48 час инкубации при 37 С представлял вирус

ИБР пассажа ПК-22.

10 мл вируса ИБР пассажа ПК-22 внесено в десятилитровую вращающуюся бутылку, содержащую монослой клеток ПК, приготовленных, как описано выше для аднолитровых вращающихся бутылок, кроме того, 1000 мл суспендированных клеток ПК добавляют для получения результата вместо 150 мл, использованных в однолитровых бутылках. Вирус из этой инокуляции собирают через 30 час инкубации на устройстве вращающегося барабана при 37 С. Этот вирус представляет собой вирус ИБР, который подвергался 54пассажам в культурах клетки бычьей почки и 23 пассажам в культурах клетки почки кролика. Этот продукт, содержащий ослабленный вирус, образует вакцину изобретения.

Вирус, полученный как описап выше, сохраняют в аликвотах различного размера в геометрически закрытых контейнерах при температуре менее, чем -10 С, нлн высушнваннем вымораживанием после добавления стабилизирующей смеси.

Формула изобретения