Способ получения гексокиназы

Способ получения гексокиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советсеа

Социалнстмнесаа

Раснубанн (11) 57 7 2 29 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) ЗаЯвлено05.07.76 (2f) 2381622/1з (51) М. Кл.

С 12 Р 13/10 С 07 Q 7/03 с присоединением заявки №

Гавудврстввкнмй квветвт

Веветв Мккввтроз СССР аа делам квобрвтвнкй а еткрыткй (23) Приоритет(43) Опубликовано 25.10.77,Бюллетень №Э 9 (45) Дата опубликования описания 10.11.77 (53) УДК 577.15.66Э. .1 (088.8) 1

3. А. Виестуре, Р, Я. Эзнс, М. A. Озолиня и А. Ф. Лидере (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕКСОКИНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения фермента гексокиназы, применяемого в молекулярной биологии и медицине.

Известен способ получения гексокиназы из хлвбопвкарных дрожжей, предусматриваюший плазмолиз дрожжей толуолом и осажде8Ме фермента сульфатом аммония (1).

При этом исходная активность гексокиназы s первоначальном экстракте исходной р биомассы составляет 4 ед/мг б.елка. Активность гексокинаэы после осаждения супьфатом а:лмония равна 6 ед/мг белка.

Однако активность гексокиназы зависит от активности гексокиназы в биомассе дрох -y жей.

Цель изобретения — интенсификация дро» цесса биосинтеза гексокиназы и увеличение активности фермента.

Даи достижения поставленной цели перед о плазмолизом дрожжи культивируют при аэрации на питательной среде, содержащей фосфат калия и сернокислый магний в течение 1-3 ч, затем в питательную среду добавляют индуктор гексокиназы- глюкозу в количестве 10-к

15% и продолжают процесс в течение 0,5-1 в

При атом фосфат калия вводят в раствор в количестве 2,7%, а сульфат магния -0,5 %.

Дрожжи культивируют при. 30 С и рН 6-7. о

По предлагаемому способу перед вкстракцивй тоболом осуществляют культивирование ис ходкой биомассы дрожжей в растворе фосфата калия с добавлением солей магния при

30 С, рГ 5 7 и режиме. аэрации 0,6 1 (воздух, культуральная жидкость) в течение

1-3 ч, -затем добавляют индуктор гвксокина зы-глюкозу в концентрации 10-15% и прВцесс продолжают в течение 0,5-1 ч.

При проведении .культивирования биомассы дрожжей с активностью-0,75 ед/мг белка получают биомассу дрожжей с активностью

8,2 ед/мг белка.

Повышение активности гексокиназы про.исходит эа счет культивирования исходной биомассы дрожжей. Культивирование исходной биомассы дрожжей проводят в двв стадии. На первой стадии введением фосфата калия и солей магния происходит активация ферментных систем клетки, в том числе ферментов цикла гликолиза. Это достигается

577229

3 путем частичного и обратимого блокирования окислительных железоферментов дрожжей, в результате чего дыхание клетки частично тормозится и поэтому активизируется ана робная фаза дыхания. На второй стадии бла- 5 годаря добавлению глюкозы в качестве индуктора активности гексокиназы в ферментационной среде осуществляется следующая реакция:

Д-глюкоза + АТФ гексокиназа Д-глюкоэо-6. фосфат + АДФ.

Таким образом по предлагаемому способу проводят вторичное культивирование исходного дрожжевого сырья. Биомассу дрожжей (500 r прессованных дрожжей на 1 л среды) суспендируюг в растворе фосфага калия (2,7% КН РО ) и солей магния (0,5%

Mg80<7H<0) и прй непрерывном перемещивании и аарации культивируют 2-6 ч, oÔ

Температура культивирования or 25 до 32 С;> рН среды 5,0-7,0, режим аарации 0,5:1 (воздух: кульгуральная жидкость), Затем к феРменгационной среде добавляют глюкозу в концентрациях 10-15%. Процесс кульгиви- у рования продолжают еще 30-60 мин. Активность гексокиназы в биомассе дрожжей составляет 8,2 ед/мг белка. Дрожжи плазмолизируют толуолом и экстракт фракциониРуют сульфатом аммония. 30

Предлагаемый способ иллюстрируется

1примерами его выполнения.

Пример 1. В качестве исходного сырья используюг биомассу хлебопекарных дрожжей 5occha vomyce& се еч si a E. 35

Прессованные дрожжи в количестве 1 500 r с активностью гексокиназы 0,69 ед/мг белка подвергают вторичному культивированию в реакторе емкостью 10,0 л. В первой стадии культивирования применяется следую 4Ь щий состав питательной среды в r:

81 0 КНХР04 15 0 М2504.7H20 1 5 л воды.

Температура культивирования 30 С. В реакторе Ь чер з распределитель подают 4 стерильный воздух в количестве 1,5 л/мин.

Кульгуральную жидкость перемешивают со скоросгью мешалки 600 об/мин.

После 2 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы дрожжей и в реактор Ж добавляют 300 г глзжозы. После агого процесс культивирования дрожжей при данном режиме продолжают 30 мин.

Полученную биомассу дрожжей отделяют

or кульгуральной жидкости на вакуумном фильтре. К онценграция гексокиназы и биомассе составляет 8,2 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность гексокинаэы повышается or 0,69 до 8,2 ед/мг белка. 60

Дрожжи плазмолиэируюг голуолом и акс1 тракт фракционируюг сульфатом аммония.

Получают ферменгагивную активность гексокинаэы 14,2 ед/мг белка, Пример 2, В качестве исходного сырья используют биомассу спиртных дрожжей. ассйа "обрусев се "Ич в а 0

Прессованные дрожжи в количеств 1 500 r с активностью гексокинаэы 0,75. ед/ мг белка подвергают культивированию в реакта ре емкостью 10 л. В первой стадии культивирования применяется следующий состав питательной среды-в r:—

81 0 КН РОд 15 0 МДДОд. 7Ну О

1,5 л вода. о

Температура культивирования 30 С. В растворе через распределитель подают стерильный воздух в количестве 1,5 л/мин.

Кульгуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 1 200 об/мин. После

3 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы дрожжей и в реактор добавляют 450 г глюкозы. После чего процесс культивирования дрожжей продолжают

1 ч, Полученную биомассу дрожжей отделяют ог кульгуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентрация гексокиназы в биомасс1 составляет 7,9 ед/мг белка. Гексоки азу из биомассы дрожжей выделяют как в примере 1.

Предложенный способ обеспечиваег повышение активности гексокиназы в биомас се дрожжей до 7,9- 8,2 ед/мг белка.

В сравнении с исходным сырьем активность повышается от 0,69 ед/мг белка до 8,2ед/мг белка и от 0,75 ед/мг белка до 7,9 ед/мг белка.

Ф ормула изобре гения

1, Способ получения гексокиназы из био массы дрожжей; предусматривающий плаэмо лиз дрожжей голуолом и осаждение фермента сульфатом аммония, о г л и ч а ю щ и и с я гем, что, с целью интенсификации процесса биосингеза гексокиназы и увеличения активности фермента, перед плазмолизом дрожжи культивируют при аарации на питательной среде, содержащей фосфаг калия и сернокислый магний в течение 1-3 ч, затем в питательную среду добавляют индукгор гексокинаэы — глюкозу в количестве

10-15% и продолжают процесс в течение

0,5-1 ч.

2. Способ по п. 1, о г л и ч а ю щ и йс я тем, что фосфаг калия вводят в расг577229

Составитель Т.,Серебренникова

Редактор P Пурнам Техред Н. Бабурка Корректор C. Патруп ева

Заказ 3543/20 Тираж 541 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал НПП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 вор в количестве. 2,7%, а сульфат магния—

0, 5%.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и йс s тем, что дрожжи культивируют при

30 С и рН 5-7.

Источники информации принятые во анима» ние при акспертизе:

1. АииаРз N.3. hocida и у of 5ietrces, 1968, 151, 1, 307.