Способ получения полипептидов

Способ получения полипептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН Ия

Союз Советских

Социалистических

Республик (t t) 577с) 75 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 26.03.75 (21) 2127597/04 (5! } М. Кл.

С 07 С 103/52 У/ А 61 К 31/3 95 (23) Прноритет— (31) 34161/74;

10878/75 (32) 26.03.74;

24.01.75 (33) Яп ония

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР ао делам изааретеннй и открытий (43) Опубликовано25.10.77.Бюллетень № 39 (53) УДК 5.17.96 4,4. .О7(сж8.8} (45} Дата опубликования описания 11.11.77

Иностранцы

Мосахикэ Фудзино, Мицухиро Вакимасу, Сигехися Тякетэми и Эйичиро Исикава (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Такеда Кемикал Индастриз Лтд (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

Изобретение относится к способу получения полипептидов, которые могут найти применение для лечения недостаточности липидного и углеводного обмена в частности для лечения сахарного диабета.

В органической химии известны различные приемы и методы конденсации, применяемые для образования пептидной связи, например карбодимидный, метод активирэванных эфиров, твердофазный синтез.

Использовав известные методы синтеза, варьируя комбинации защищенной и активированной форм карбэксильной и аминогрупп в исходных соединениях, получают новые полипептиды, обладающие ценными фармакэ15 логическими свойствами.

Предлагается способ получения полипеп — тидов обшей формулы

R — А g — R — Phe --Phe --В

20 где Я вЂ” атом водорода или остатск основной или нейтральной аминэкислоты;

R — нейтральный яминокислотный оста2 ток;

}(Н, Т5 Р— NH, остаток тирэзиль 25

3 ного пептидя, содержащего в своем составе от 1 до 5 яминокислотных остатков, или остаток амида тирозпльного пептида прп условии, чтэ, когда К„ представляет собой атом водорода, R сэо уст РРО, заключающийся в том, что аминокислоту, соответствующую R, или аргинин в том случае, когда К представляет собой ятэк1 вэдорода, или пептидный фрагмент пэлипептида указанной формулы, содержащий амин»кислотный остаток R или аргинильную груц ( пу в Т0М случае, когда Р„представляет собой атом водорода, в качестве:Р -KoHцевой аминокислоты, конденсируют с недостающим фрагментом полипептида указанной формулы, причем каждое из исходных соединений может быть защищено по своим аминс- и карбокспльным группам, которые не должны принимать участия в конденсации, и может быть активнровано по тем амино- или карбэксильным группам, которые непосредственно участвуют в указанной реакции конденсацп;„ и после завершения конденсации эти группы удаляют из полученного лолипептидногэ продукта.

577075

Для обозначения аминокислот, пептидов, активирующих и защитных группировок и реагентов, используемых для активации и защиты аминокислот и пептидов, применяк>тся следукядие сокращения: с — А OU -аминомасляная кислота; — АЬи — p --аминомасляная кислота; — Ac.Op- " -аминокапроновая кислота;

Мц-аланин; p - ИО -аланин; Arp -аргинин; 8 - A%et -аминовалериановая кислота; 0(., )" - );) дЬ dL, - -диаминомасляная кислота; 6(y -глицин (гликокол) „А" —

-гистидин; L

-трет-амилоксикарбонильная группа;  —

-бензиловый эфир; DOc: N, N --дициклэгексилкарбодиимид; г(ОН В вЂ” и -окси-5-норбэрнен-2,3-дикарбоксимид; О Вт. F -сложный бензиловый эфир; OD М Р -2,4-динитрофенилэвый эфир 0 E l этиловый эфир„ О)(В -эфир HG основе окси-5-карборнен-2,3-дикарбоксимиАа; Dpcp -пентахлорфенилэвый эфир; Ocu—

- И -оксисукцинимидный эфир; ОЮо -трет-бутиловый эфир; Tas -тозильная группа; -бензилоксикарбонильная группа; ВОС

-трет -бутилоксикарбонильная группа.

Когда В представляет атом водорода, группировка Я„ - Arg обозначает следующую аргинильную группу

ЯЯФ 3

МН2

Термин аминокислотный остаток" подразумеваетт группировку, способную образовывать пептидную связь, например группу, представляющую собой аминокислоту, лищенную одного или обоих атомов вэдорэда от аминогруппы (или аминэгруппы в случае иминокарбоновых кислот) и от гидрэксила карбоксильнэй группы.

Основные или нейтральные аминокислоты, обозначенные R, содержат в предпочтительном варианте 2-10 атомов углерода.

В Качестве примера основных аминокислот, использованных для получения предлагаемых полицептидов, можно привести такие аминокислоты, как 0(., P -диаминэпропионовая кислота,; ciL f3 -диаминэмасляная кислота, аргинин, лизин и гистидип. В качестве примера нейтральных аминокислот, подразумеваемых пэд R<, можно указать такие аминокислоты, как глицин, аланин, серии, тре э нин, c(- -ймпн эм аслян чО к исл э-ту, пролин, лейцин, изэлейцин, эрпешшн, фенилаланпн и тирэзин, а такж» другие ами-нокислоты, такие, как P -алании, .-аминомаспяная кислота, 3 — аминовалериановая кислота и f — аминокапроновая кислота, Для тех аминокислот, которые могут существовать в виде оптических изс меров, К обозначает любой из оптических изомеров соответствующих аминокислот или рацемические соединения. Среди аминокислот, соответствующих R4, P -аланин явi0 ляется особенно предпочтительным для целевого использования.

Нейтральные аминокислоты, представленные R, содержат предпочтительно

2-10 атомов углерода. Примером таких

l5 аминокислот является глицин, аланин, р

-аланин, саркозин, серии, прэпин, валин, лейлин, нзолейцин, фенилаланин и тирозин. Среди аминокислот, соэтветствуннпих R», глицин и пролин являются наиболее предпочтитель 20 ными для использования по указанному назначению. Б случае, когда R2 представляет остаток пролина, целевое применение достигается даже в том случае, когда К представляет собой GTDM водорода.

25 Аминокислоты, которые мэгут входить в состав тирозильных пептидов или их амидов, содержат предпэчтительно 2-10 атомов углерода каждая. Примерами таких аминокислот являются глицин, аланин, серии, З0 треонин, валин, пролин, лейцин, изэлейцин, лизин, фенилаланин и тирозин. Эти аминокислоты связываются в любой последовательности с образованием тирозильных пептидов или их амидов, содержащих в своем составе от 1 до 5 аминокислотных остатков, Такими тирозильными пептидами и их соответствующими амидами, котэрые иногда называются "амидами тирозильных пептидов являются, например, следующие соединения:

Tyr — GEM- ОН;

Т,г-АЕ-С,Е -ОН;

Tyr - Le u - AEa- GKy- ОН;

Tyr Leu- Е,ЕЧ-Vae-AEo- ОН;

Т г- Thr- Рга - Leu- The-CIH;

Т r - Тh г - Pro — Lys - Aeoi-OH;

Tyr- Thr-Рго-Lys- The-OH;

Тчт - бег -Рго- Arg С Е - ОН;

Tyr - Pro — ЭЕе — oH;

Tyv- Leu -Leu- Leu-ОН;

50 xyr - c ey- с„е -с,е -cey-он;

Т г - АЕа - ДЕ -aeoi- ЛЕ0- аН;

Т1r - Тhr Pгэ Lyg - ОH.

Среди аминокислот, тирэзильных пептидов и их амидэв Тчг — NН> является наиболее предпочтительным для целевого назначения (для получения предлагаемых полипептидов), в Т0М числе и для промышленного производства пэлипептидов.

В том числе, когда аминокислот i, пред6О ставленные Р или входящие в со»чав I1 у i2

577975

Пример 1. Получение Arg — Wa— — Phe — Phe — Tyr — И и .

A. Получение Z — P,pg (ЯО ) — Ргб.— — РМ вЂ” Phe — Туг — N H>.

10Л г 8 —. РЬе — phе — Ту1 — NH растворяют в 50 мл диметилформамида (ДМФ) и восстанавливают над палладиевой чернью.

Через 10 ч катализатор отфильтровывают, фильтрат охлаждают в ледяной бане H K Ox лажденнэму раствору прибавляют 7,37 г

Z — keg (gQ ) — Pro — 0H и 3, 3 г

НО8 В (И -экси-5-нэрбэрнен-2,3-дикар боксамида), туда же прибавляют 4,06 г дицшлогексилкарбэдиимида (ДПГКДИ), и реакционную смесь перемешивают в течение

16 ч. Обр;,зэвавшуюся дициклогекснлмочевину (ДЦГМ) отфильтровывают, фильтрат. упаривают при пониженном давлении. К оста ку прибавляют 200 мл этилацетата н полученное при этом твердое порошкообразное вещество отделяют фильтрэванием. Осадок чистят перекристаллизацией из смеси ДМФ

/метанол/вэда. Выход продукта 14,5 г (95,6,о от теэретическэгэ); т.пл. 100 .103 С; (cd) — 29 7э (с = 0,55%, ДМФ).

Найдено, ": С 59 51; Н 6,06; М 14,90, 4Ь 54 1о 1о

Вы исленэ, %: С 5Э, (3; Н Ъ, 10;

Ц15,11 пы R>, могут существовать в виде оптических изомеров, эти аминокислоты могут иметь любую оптическую конфигурацию (могут быть любым оптическим изомерэм) или представлять собой рацемическэе соединение.

Реакцию конденсации можно проводить, используя приемы и методы конденсации, известные для образования пептиднэй связи.

Перед проведением реакции конденсации можно защитить карбоксильные и аминные группы, которые не должны принимать участия в рассматриваемой реакции, или, наоборот, активирэвать карбоксильную и/или аминную группы, которые должны участвовать в этой реакции. Все операции по защите или ц активации функциональных групп реагирующих веществ осуществляются известными методами. Карбэкисльные группы в исходных веществах, которые не должны вовлекаться в реакцию конденсации, могут быть защищены солеобразованием, т,е. переводом в соответствующие металлические сопи (например, натровые или калиевые соли) или этерификацией, что связано с получением соответствуюших сложных эфиров (например, метилового, этилового, бензилового

А-нитробензилового, трет,-бутилового или трет.-амилового) .

В качестве зашитных группировок для аминогрупп исходных соединений могут быть 30 использованы любые известные защитные группировки, которые применяются в пептидном синтезе, например бензилоксикарбонильная, трет.-4утилоксикарбонильная, трет-амилоксикарбоййльйая,. изэборнилоксикар- 35 бонильная и другие группы Эти защитные группировки могут использоваться для зашиты иминогруппы пронина. Имидазольная функция гистндина может быть защищена с помошью любой применяемой для этой цели 40 защитной группы, например бензильной, тозильной, 2,4-динитрофенольнэй, трет.-бутилоксикарбонильной или бензилоксикарбонильной. Гидрэксильные группы серина, треонина и тирэзина могут быть защищены лю- 45

5эй обычно применяемой для этой цели защитной группой, например бензильной, трет,-бутильной или другой группой, способной образовывать простой эфир. Гуанидиновая группа аргинина может быть защищена та- 50 кими группами, как нитрэгруппа, тозильная, бензилэхсикарбэнильная, изэбэрнилоксикарбэнильная или адамантилэксикарбэнильная, В качестве примеров ахтивирэванных карбоксильных групп в исходных соединениях мож-55 нэ назвать соответствующие ангидриды, азиды, активирэванные эфиры (например, пентахлэрфенилэвый, 2,4,5-трихлэрфениловый, 2,4-динитрэфениловый, Lilt;. и.летилэвый, П -нитрэфенилэвый, -эксисуl:иинимидный,60

Я

" -окси-5-нэрборнен-2,3=-двкарбоксимидный, И ьксифталимидный или М -DKcHбензэтриазэльный).

Реакцию конденсации мэжиэ проводить в присутствии растворителей, широко используемых в пептидном синтезе: безводный или водный диметилформамид, диметилсульфоксид, пирндин, хлороформ, диоксан, метиленхлэрид (дихлэрметан), тетрагидрофуран, а также различные смеси этих растворителей.

Температуру для проведения реакции конденсации выбирают в пределах диапазона, относительно KoTорогэ изие тно, что оН является приемлемьцл для проведения реак: ций, приводящих к образованию пептидных связей.

После проведения реакции конденсации в том случае, кэгда пэлученный продукт содержит защитные группировки, их удаляют обычными методами, применяемыми для этих целей, например, каталитнческим вос- становлением в присутстмж соответствуюmer o катализатора, такого, как палладиевая чернь, палладий на угле, платина и т.g.; сэльвэлизэм с использованием фтэристого водорода, трифторуксусной кислоты и так далее, 8 также восстановлением металли» ческим натрием в жидком аьъшаке.

577975

Б. Получение Arg — Pro — Ph e — Phe—

TVr — )) и °

100 мг Z — AгО (ИО) — Ргo — phе— — Phq — ууг ЯЯ растворяют в 30 мл уксусной кислоты, восстанавливают над палладиевой чернью, используемой в качестве катализатора гидрирования, в течение 20 ч, Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении.

Полученный остаток растворяют в 50 мл воды, фильтруют, фильтрат сушат лиофилизацией. Лиофилизованный продукт растворяют

g 5 мл воды и раствор вносят в колонну (1,8 х 9 см), заполненную карбоксиметилсефадексом, проводят градиентную элюцию

0,1 М водным раствором ацетата аммония (400 мл) и 1 М водным раствором ацетата аммония (400 мл). Фракции от 250 до

370 мл, объединяют и,пиофилизуют, Получают 250 мг (52,3% от теоретического) белого пушистого продукта; (Й3 -41,9о (с 0,47%, вода) .

Аминокислотный анализ продукта (гидролиз проводят соляной кислотой в стандартных условиях): Аг(э 1,00; 9ро 1,05;

Ъг 0,91; Phe 1,96 (содержание пептида в продукте 86,5%).

Найдено, %: С 56,76; Н 6,98; Й 14,28

Вычислено, %: С 57,06; Н 6,96;

N 14,26

Пример 2. Получение Gfy — Агав — Рго — Phe -Phe — Tyr — NH<.

А. Получение 3 — Qfg — gg q — Рго — Phe — Pbe — Tyr — ИН .

80 Z — Лr (X0 j=P«Phe — Phe — Туг — NH растворяют в 30 мл уксусной кислоты и Гидрируют над палладиевой чернью в течение 8 ч. Катализатор отфидьтровь вают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 20 мл воды и лиофидизуют.

Полученное в результате порошкообразное вещество растворяют в 10 мл ДМФ, к раствору прибавляют 147 мг моногидрата )1 - голуолсудьфокислоты. К полученной смеси прибавляют 349 мг Х- ч-0N5, реакционную систему перемешивают в течение 10 ч, ДМФ отгоняют при пониженном давлении, к остатку прибавляют 50 мл этилацетата. Полученное при этом порошкообразное вещество отделяют фильтрованием.

Выход продукта 858 мг (89,5% от теоретического); т.пл. 119-121ОС; (+)1 -26,7о (с = 0,96%, ДМФ).

Найдено, %: С 59,45; Н 6,08; И l 2,37

6 2,76 дв Ну.й Оч Н,<, С Нр0 5 Н О и

Вычислено, %: С 59,55; Н 6,18, И 1.2,63

О 2,89

Б. Получение Gty — Хгу — Pro — Phe— — РК@ — Tyr — ЯН я

500 мг Z — Gfy — Ащ — Pr о — Pbe— — Phe — Туг — NH> n -толуолсульфоната растворяют в 30 мл уксусной кислоты, восстанавливают над палладиевой чернью в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывают

tO и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 20 мл воды, и полученный раствор подвергают ионообменной хроматографии на колонке с Амберлитом JR A -41С в ацетатной форме (Atnbet Riage А%А -410 !

5 представляет собой сильно основную анионообменную смолу) . Элюат лиофилизируют и полученное в результате порошкообразное вещество растворяют в 5 мл воды.

Зтот раствор наносят на колонку (2,6 х 23 см)

20 с карбоксим етилцеллюлозной. Злюцию осуществляют градиентным методом с использованием двух водных растворов ацетата аммония: 0,005 и 0,2 М (по 700 мл каждого полученного в примере А раствора) с нарастанием концентрации элюента. Фракции в диапазоне от 840 до 970 мл объединяют и лиофилизируют. В результате получают 270 мг (63,6% от теоретического) целевого продукта; (сА.),1 -62,0о (с =0,46%, ЗО Вода) .

Найдено, %: С 55,99;Н 6,92; г(14,77

Вычислено, %: С 56,15; Н 6,82; И 14,89

Аминокислотный анализ: Аг Г0,94; Рго

1,06; Ич 1,00; Тчг 0,94, phe 2,03 (содержание пептида 83,2%), Пример 3. Получение г- — Авив

4p — Arg — Рго — phe — phe — Tyr — и Н,.

Процедуру, описанную в примере 2 повторяют с той только разницей, что вместо

i- С -0 >,,, Z- g- ASu-0NB

В результате получают 324 мг указанного

4> соединения; (ck) -58,7о (с = 0,45,aoga).

Найдено, %: 56,14; Н 7,36, 8 13,92 с„,н, о н гс н о ьн о

Вычислено, %:С 55.97; Н 7 15

N 14,19

Аминокислотный анализ: А 1,00; Pt o

1,08; 1 ч 0,97; РМ 2,13 (содержание пептида 80,8%) .

Пример 4. Получение Š— Acap—

55 — А г — Prо — P h е — Ph e — Tyr — ЙИ

A. Получение Z — — Aсoр — Аrg— — Р1 о — P he — Ph е — Туг — г) Н .

В 10 мл ДМФ растворяют 250 мг

50 Z - 6 -Асар-OH и к полученному раствору

577075 при охлаждении на ледяной бане прибавляют

186 мг НОЙВ и 214 мг ДШКДИ.

Смесь перемешивают в течение 16 ч, образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают.

Фильтрат прибавляют к диметилформамидному раствору Н вЂ” A t g — Pro — Pht —

— Р f. е — 3 уг — N H < n -толуолсульфоната, который получен по методике, описанной в примере 2А. Смесь перемешивают в течение 12 ч, ДМФ отгоняют при пониженном давлении. К остатку прибавляют 30 мл этилацетата и образовавшееся при этом порошкообразное вещество отфильтровывают. Выход продукта 810 мт (79,1% от теоретического); т.пл. 90-92 С; (АЗ в

-30,3о (с = 1,07%; ДМФ).

Найдено, %: С 59,81; Н 6,75; Н11,80;

5 3,00

5г ь6 0 1о 1 9

Вычислено, %: С 59,88 Н 6,65;

jV11,84; 5 2,80

Б. Получение Я- Ас iр Arg pro — Рпе — Phe — Tyr -НЯг.

500 мг Z -производного, полученного в примере А, обрабатывают IIQ примеру 2Б, в результате чего получают 316 мг указанного соединения. (сй 8,9 С (с =

-ra o

= 0,55%, вода) .

Аминокислотный анализ: Агу 1,02; Pro

l,03; T t 0 92; Phe 2 13; E -Асар не определяли; (содержание пептидов 81,5%).

Пример 5. Получение Lys k — Рго — Ph e — Phe — Tyr — ИН .

А. Получение ди- Š— Lys — Arg — Рго— — Pht — Ph е — Гуг — NHg

Процедуру из примера 4А повторяют с тем исключением, чта вместо Z — Я—

-Асар-OH используют 390 мг ди- X — US

-ОН, в результате, чего получают 932 мг указанного соединения, имеющего т.пл.

103-105оС (chl -28,5о (с = 1,04%, ДМФ)Найдено, %: С 60,64; Н 6,21; г(11,79, а 2,82

Вычислено, %: С 60,39; Н 6,43;

К 11,56, 52,41

Б. Получение Lys — Arg — Рго — Ph е— — Рие — Туг — М г

500 мг ди- х -производного пептида, полученного в примере А обрабатывают по примеру 2Б, в результате чего получс.ют

336 мг указанного; fck3

21

-52,6оС (с = 0,57%, вода).

Аминокиспотный анализ: Les 1,02; Arg

0,98, Pro 1,00, T r 0,94;9he 2,04 (содержание пептида 91%).

Пример 6. Получение с4р Da6

1г - Рго — Phe — Phe -- (уг -- 1ЧНг.

Аналогично примерам 4 н 5, на исх. пя из 535 мг ди- 7. — < — у — 3olh -пиппкл — гексиламманийнаР соли, синтезирован указаиио соединение с выходом 325 мг," (о(11 -58,2 С (с =0,50%, вола). г г

Аминокислатный яналиэ: d., .г — Эс Ъ

1,0о; А g 0,98; Trî 1,00; т»

РЬ® 3,96 (содержание пептида 84,2%) .

Пример 7. Получение в 4ta .

l0 — Аг — Pt o — Phe — phe — Tyr — ч)(.

А. Получение, — б — A(a — - pr® (go ).. г — Pro — Olf e.

К 3,50 г Z "1д(Й0г) — Рго — 0Me прибавляют 35 мл 25%-ного раствора

15 НВ1 в ледяной уксусной кислоте. Реакционную смесь встряхивают при комнатной температуре в течение 35 мин. К этой смеси прибавляют 300 мл диэтиловаго эфира, образовавшийся при этом осадок от20 фильтровывают, промывают эфиром и сушат.

Полученный порошок растворяют в 20мл

ДМФ и при охлаждении ня ледяной бане нейтрализуют раствором триэтилямпня. Затем прибавляют 2,9 г 1- (3 Мо -ONE u

Ж перемешивают в течение 16 ч. ДМФ отгоняют при пониженном давлении, остаток растворяют в 300 мл этилацетата. Полученный раствор трижды промывают 4%-ным водным раствором бикарбаната натрия (порЗО ции по 100 мл). После промывки водой раствор сушат над безводным счльфятом натрия. Растворитель отгоняют при пониженном давлении и к остатку добавляют этиловый эфир. Полученное при этом парашЗа кообразное вещество отделяют от маточного раствора фильтрованием. Выход продукта

3,05 r (74,3% от теоретического), т.пл.

62 65оС. (о ) g «34 1а (с = 1 04% ДМФ)

Найдено, %: С 50,98; И 6,36; К 17,72

Вычислено, %.. С 50,73; Н 6,2. ., и 18,01

Б. Получение K — я-АЬ вЂ” Аг (яОк) — Рга — ОН.

В 30 мл ацетона растворяют 2,82 г

Š— /Э вЂ” А(о — A Q(O<) —. Рго — ОМ е, полученному раствору, охлажденному на ледяной бане, грибявляют 10,7 мл 1 н. водного раствора гидроокиси натрия. Реакци онную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем смесь нейтрализуют 11 мл 1 н. соляной кислоты, раствор упаривают при пониженном давлении.

К полученному млслянистал у остаткУ прибавляют 30 мл холодной воды и водный слой отделяют дека ггацией. Остаток промывают адин раз холодной водой и сушат, после чего этот продукт храматаграф руюя. на копанке с силикагелем (90 I ), t . . и-577975!

1. Х-P-Afa — Ащ(%Ой) — Рро -Phe — ОН+и -Phe-Т р 5Н<

НОМ3 ЗСС

X -P -Ala — Аг (ЫО й) — Рт 0 -Phe — Phe — Ту — НН я

Я Pd или HF

Р-И вЂ” Aeg-Ppo- Phe P1lt. — Ту -NHg

Q. X — P Ala-Лту(ХО ) — Рт о — Phe — Phe — ОН +Н-Ту -HHg

) нов/асс

X-p-Л1ц-Лт я (NOй) — Рро — РИе — РЬе -Tyc -M4g

Н Рс1 или HF

Р -Л)ц-Avg-P -Phe -Phe -T -748g

3. L=P —.Щи — фу-ОИ +Щедро -Р1 е -Pll< -Typ Щр

Н(-1 БОИВ ЭСС

z — p — Ala — Ат ф — Р1 о -Р11е -The — тут - NH g

Н Рд

p — Ala — Айу — Рго — Pile -Phe - Tyr-МН р зуя в качестве элюента систему этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода (60:

:20:6:11). Фракции, обэгаше ные ожидаемым соединением, объединяют и упаривают досуха при пониженном давлении. Остатэк промывают этиловым эфиром и отфильтровывают. Выход продукта, 2,62 г; т.пл.

65-67оС; ta) l -27,5 (с = 1,07%; ДМФ)

Найдено, %: С 50,41; Н 6,19; Й 18,58 мos "

Вычислено, %: С 50,66; Н 5,99, ((18,80.

С. Получение Š— Ю вЂ” Akt — Л1 (1 (MO )Pro Phe — Phe — Ty r — ЙНк

1,50 г Z — Phe — Phe — Ру — ИН растворяют в 15 мл ДМФ, гидрируют над палладиевой чернью в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывают, фнльтрат охлаждают на бане со льдом и к охлажденному раствору прибавляют при перемешивании

1,2 1 г Е - P — А1а — A rg (NO>) — Рго — OH, 0,53 r НОЯ В и 0,61 г ДЦГКДИ. Реакционную смесь перемешивают в течение

18 ч. образовавшуюся ДОГМ отфильтровывают и фильтрат упаривают при пониженном давлении. К остатку прибавляют 50мл воды, фильтруют, оседок собирают, сушат, Переосаждают из ДМФ этилацетатом. Выход продукта 1,99 r (80,9% эт теоретического); т.пл. 135-138оС, (с(,) -33,1о (с = 0,9, ДМФ).

Найдено, %: С 58,93; Н 6,18; 5 15,02

Вычислено, %: С 59,08; Н 6,17;

N 15,47

12

Д. Получение,8 — А1а — Ьг (— Рго— — Phe — Phe — Туг — NH g

В 40 мл ледяной уксусной кислоты растворяют 1,50 г Š—,8 (Иа Prg(jf()Z)— — Pr o — Phe — Phe — Ту — 1Щ, « » ,Z -зашитную группу гидрэгенолизом (нед палладиевой чернью в течение 8 ч). Катализатор отфильтровывают и фильтрет уперивают прп пониженном давлении.

ОстатоК растворяют в 50 мл воды, отфильтровывают небольшое кэличествэ нерастворившегося веществе и фильтрат лиэфилизуют. Лиофилизованный прэдукт растворяют в 20 мл воды, полученный раствор наносят на колонку (3,0х28 см) с карбоксиметилцеллюлозой. Элюцию осу|пествляют градиентным методом с использованием

0,005 и 0,2 М водных растворов ацетата аммония {по 1,5 л каждого растворе). Фракции от 1490 go 1840 мл элюата объединяют и лиофилизуют. Выход продукта 980 мг (65,7% от теоретического); j+) -59,1э (с = 0,52%, вода).

Найдено, %: С 54,34, Н 6,98;

1 (13,98

Вычислено, %: С 54,53; Н 7,12, 30 N 14,13

Аминокислотный анализ: Д р1,00; P c

1,11; Т 1,00; PhO 2,11; Р 4fu 0,94 (содержание пептида в образце 75,7%).

Аналогично примерам С и Д то же целевое соединение можно получить в соответствии со следуюшей реакционной схемой

577975

-Qr-5H и, используя в качестве катя;;кзатэ2

13

Пример 8. Получение,в — А(а— — Arg — Pro -- Phe - Phe — NH2.

Аналогично примеру 7, но с заменой

7 — Phe — Phe -- Т»П - — МН2 на

Х вЂ” Р4е-- phe — — ЯН2 получают 1,24 r указанного сэединенкя в виде белого пушистого продукта; Щ -48,6о (с = 0,42%; вода) .

Амянэккслотный анализ: A>g 1,08, Р ч

1,00; РИе 1,98; 15 АГс» 0,97 (содержание пелткда 82,6%).

Пример 9. Получение Д вЂ” Яа — А» »р — ф — A(a - — Рбе — Phe — Т » — HH2 .

А. Получение 2 —,6 — Л1сi — Phe.—

— Pbe — 1уг — ЯН

l5

2,00 r Z — phe — phe — Туг — NH2 растворяют в 40 мл ДМФ к гидрируют над палладкевэй чернью в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывают я к фильтрату прибавляют 1,39 г Z- P-Afoul-ОМВ . Реак- О ционную смесь перемешивают в течение9ч и ДМФ отгоняют при пониженном давлении.

К остатку прибавляют 50 мл воды, получившийся при этом порошок отделяют фильтрованием и сушат Полученный продукт чистят перекристаллиэацией из смеси ДМФ/

/зтклапетат. Выход продукта 2,02 г (88,0% от теоретического):, т.пл. 232 C;(4.) 23 4> (с = 0,94%, ДМФ).

Найдено,%: С 65,18; Н 6,20; N 10,32

Вычислено,%; С 65,41; Н 6,21, И 10,04

Б. Получение Z — Агэ (М0) — 6 фс РЬе — Phe - Т - — NB

В 30 мл ДМФ растворяют 1,0 r g— - P— — А»а -Phe — РЬе -Ту» -ИН и, используя палладиевую чернь в качестве катализатора, гидрируют в течение 6 ч. Катализатор отфильтровывают и к фильтрату прибавляют р р Z-Av((WO )-On I р -4О гидрофуране (указанный динитрофениловь.й эфир получен из 0,52 г 7- Al g(NO )" N и 0,30 r2,,4-динитрофенола в 10 мл тетрагидрофурана дициклогексилкарбодиимидным

45 методом). Реакционную смесь перемешивают втечение 13 ч,,растворитель отгоняют в вакууме. К остатку прибавляют 50 мл воды, полученное порошкообразное вещество отфильтровывают и сушат. Выход продукта:

1,01 г (74,9% эт теоретического); тпл.

192 194эС ° l

ДМФ).

Найдено,%: С 57,63, Н 5,93; . N 15,61

Вычислено,%: С 57,63; Н 6,16;

)» 15,28

С. Получение Z — P — Ate — Apg (Я02)— —,6 — А (a — P he — Ph e — ТУ» — — МН2 .

ЕО

К 700 мг Z j6 — А(а Ья (НО) Ф вЂ” А»а — Pb e — P»» e — Pyr г»Я пркбявпяют 0,2 мл анкзэла р. вслед эя зткм 7мл

25% Н В» в ледяной уксусной кк»-.лоте.

Смесь встряхивают прк кэмкяткэй температуре в течение 40 мик, после чссэ к ней прибавляют 100 мл этилового зфкря, выпавший при зтэм осадок отфильтровывают и промывают ня фильтре зтил вым эфиром. Осадок тщательно высушивают. рястворяют в 10 мл ДМФ и нрн эхляждеккк льдом нейтрализуют раствор тркзткпя кнэм, Вслед за этим в реакционную с»сто.ну ввэдят 336 мг Х- P— - АГс»- 0N5 и раствор перемешивают в течение 18 ч. B пя п-,» Ашем отгоняют ДМФ прк пэки кекнэм д, влении и к остатку после упярквяккя реакционного раствора прибавляют 50 мл вэпьr.

Образовавшийся прк зтэм эсядэк отделяют фильтрованием, сушят к пересажпя т кэ

ДМФ и этилацетата. Вых. » продукта 560 мг (73% от теэретическэго); т.пл. 200-202эС (разложение); (ek) -7.3э {c = 0,<-»1%;

ДМФ) ..

Найдено,%: С 58,06; Н 6,4 (; М 15,57

Вычислено,%: С 58,19; Н 6,13

М 15,89

Д. Получение, — А(х — Л rо — 8 —— — At e» — Ph e — Ph e — ТУг — N H2

В 30 мл ледяной уксусной к 1слэты растворяют 400 мг эащ пценнэгэ пепткда —,4 — А»а — Arg (NQ2Д вЂ”,3 — А(а -- Р{тв — Ph e— ра палладиевую чернь, гкдркруют в течение 8 ч. Катализатор удаляют фильтрованием, раствэрктель отгоняют прк пэккжекном давлении. Остаток растворяют в 5 мл и полученный раствор наносят ня кэлэкку (2, 6 х 22cM) с карбокскметклцеллюлозой.

Градиентную эгпоцкю проводят с кспэльзэванкем 0,005 и 0,2 M водных растворов ацетата аммония (пэ 700 мл каждого раствора). Фракцкп элюата эт 720 дэ

870 мл объединяют и. лиофилиэую г. Получают 270 мг (69,1% от теоретического), белого пушистого продукта, (с{.1, -17,2

Z2 (с = 0,53%, вода).

Найдено,%. С 54,52-; H 6,96, N 15,00

С„Н„а,q -„-C,НР,. Н 0

Вычислено,%: С 54,53; Н 7,03; Ь»14,79

Аминоккслотный анализ: Arg 1,00; 1м"

l,00, 9)»е 2,03; Р-А»с» 2,14 (содержанке пепткда 79,0%).

Пример 10. Получение Arm — Arg-, J3 — А!о. — РЬŠ— Phe — Т г — МН2

Аналогично примеру 9С, нэ с заменой

Z.-P- АЕ»- О »В»a 34O Z-

15 получают 297 мг указанного соединения в виде белого пушистого порошка" j6.)- -18,9

{с = 0,62%, вода).

Лминокислотный анализ: А g. 1,02; Ма

1,04; ТЭр 0,97, Р)зе 2,0; р - АГа 0,97

{содержание пептида 81,0%) .

Пример 1,1. Получение .,6 — Иа— — h,rg — gas — Phe -РЬе — Т г — МН2.

А. Получение « — Ьаг — phe ph e — — (4 1а

В ЗО мл ДМФ растворяют 2 ;02 r Z-РЬ@" ) Ьа -7 Р- И и используи в качестве катализатора налладиевую чернь, гидрируют а твчвиив 5 ч. Катализатор отфильтровывают и фильтрат охлаждают. От- д дельно расТВ 810 мг - 5cAl" - ОИ в

10 мл теграгидрофурана и к рас гвору до баалиют 0,71 г АЛОИЗ. Смесь охлаждают до 0оС и прибавляют к ней 0,82 гДБГКДИ, Полученную реакционную смесь перемешива- 20 ют а течение 3 ч. Образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают, фильтрат прибавляют к охлажденному днметилформамидному раствору. Смесь перемешивают в течение 20 ч, после чего растворитель отгоняют при по- 25 ниженном давлении и к остатку прибавляют

50 мл воды. Полученное при этом порошкообразное вещество отделяют фильтрованием и переосаждают из смеси ДМФ/этишщетат.

Выход продукта 1,90 г (83,8% от теорети- Зо ческогo), т.пл. 246-248оС (разложение); (А) -9,7o (c = 1,О7%; ДМФ).

Найдено,%: С 66,32; Н 6,39; N 10,52 ьен110759 и 2 Н2О

Вычислено,%: С 66,26; Н 6,15; N10,17

Б. Получение л — Агу (ИОя) — Ваг— — Phe — Pb< — Tyr — ИК .

В 10 мл ДМФ растворяют 1,0 г F — Ьаг — РЛе — Phe — Гуг ЯН и, используя в качестве катализатора палладиевую чернь, 40 гидрируют B течение 7 ч, Катализатор от» фильтровывают и фильтрат охлаждают. Перед этим в отдельной реакпионной системе растворяют 0,52 г Z- Д т (у (М О ) - OH в

10 мл тетрагидрофурана и при охлаждении льдом прибавляют к раствору 0,3 r 2,4-динитрофенола и 0,33 г ДЦГКДИ. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч, образовавшийся осадок ДЦГМ отфильтровывают и фильтрат прибавляют к диметилфор50 мамидному раствору. Смесь перемешивают в.течение 20 ч и упаривают при пониженном давлении. К остатку прибавляют 50 мл воды и образовавшийся при этом осадок от55 фильтровывают. После высушивания полученное порошкообразное вещество переосаждают из смеси ДМФ/этилацетатгэтиловый эфир. Выход продукта 1,04 r (77,2% от теоретического), т.пл. 96-98оС (А)

7,3о (с = 1,06%; ДМФ).

16

Найдено,%: С 57,60; Н 6,10; N15,01

Вычислена,%; С 57,63, H 6,16; N15,26

С. Получение 2 — ф — А(а — Arg (МОк)— — Заг — Phe — Phe — Туг — NH<.

В 7 мл 25%-ного НЬ в ледяной уксусной кислоте растворяют 700 мг

- гц®Д-Ъи — Fh&-Phe-Т г ЯН и 0,2 мл аннзола и раствор встряхивают при комнатной температуре в течение 40 мин. К реакционной смеси прибавляют 100 мл этилового эфира, и полученный осадок отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат над гранулированной гидроокнсью натрия в течение 2 ч, Высушенный осадок растворяют в 10 мл

ДМФ, раствор охлаждают на ледяной бане и нейтрализуют триэтиламином. Затем npuGeanmer 336 m Z-Р— - аЕ х-ON> a раствор перемешивают в течение 20 ч. После этого растворитель (ДМФ) отгоняют при пониженном давлении и к остатку прибавляют 50 мл воды. Полученный при этом порошкообразный осадок отфильтровывают и после высушивания переосаждают из смеси ДМФ/этилацетат. Выход продукта 590 мг (76,5% от теоретическогo); т.пл. 135138оС, (А) -15,5о (с = 0,99%; ДМФ).

Найдено,: С 58,18, Н 6,40; Я 15,60

47 %7 11 11

Вычислено,%: С 58,19; Н 6,13; N15,89

Д. Получение — 8 — Ala — Агц — Gmp— — Р— Л вЂ” т г — МН .

В 30 мл уксусной кислоты растворяют

450 мг защищенного пептидного производного Z — 8 — Ata,— 4д — Sar — РЛе — РЬе — 7yr — NH н в присутствии палладиевой черни гидрируют в течение 8 ч. Катализатор отфильтровывают и фильтрат концентрируют в вакууме досуха. Остаток растворяют в 5 мл воды и хроматографируют на колонке (2,6 х х 22 см), заполненной карбоксиметилцеллюлозой. Градиентную элюцию проводят с использованием 0,005 и 0,2 N водных расгворов ацетата аммония (700 мл каждого раствора), причем целевое соединение выходило из колонки во фракциях от 770 до

880 мл. Эти фракции объединяют и лиофилизуют, Получено 309 мг (70,4% от теоретического) белого пушистого продукта, (Ь) -21,5о (с = 0,46%; вода).

Найдено,%: С 54,99; Н 6,76; > 14.58

Вычислено,%: С 54,53; Н 7,03; И 14,79

Аминокислотный анализ: АРр 1,00; Гчп

О.88, Phe 2,02=, р-,Ае 0,98, S r определялся (содержание пептида 78,7%) .

Пример 12. Получение l,eu — Arg— — Pro — Phe — Phe — Tyr -- !ЧНд.

l а

/0

И 14-,62 бО

17

А. Пэлучение 2 — 1.еи — — »,vq{gQ>)— — Р».о — Phc — Ph e — ТУà — НН .

В 20 мл ДЯФ растворяют 700 лг

Р»» -рИе-"»-» », и гидрир лат над пал— ладиевой чернью в течение 6 ч. Катализатор отфильтрэвывают и фильтрат эхла;кдают, К этому фильтрату прибавляют 648 мг карбэксильнэго компонента Z7- Lev - И ц (»» О 1=РРО-ОН, а затем 247 мг НОЯ В и "-"Ð5,.г

ДЦГЯДЯ Смесь перемешивают в .Гечент е

20 ч, образовавшийся эсадэк дипиклэгексилмочевины Отфильтровывают и Дур!Ф отгоняют ри пониженном давлении. Y стат -. ку прибавляют 50 мл воды и пэлученн-е порошкообразное веиество неренэсят на филь р. Продукт сушат и пере осаждают из смеси ДМФ/этилацетат/эфир, т.пл. 1 10111ОС; (а322 38ЛО (с = 1,0%; ДМФ), Выход продукта 1,05 г (86,5% эт теэре=тического) .

Найдено,%: С 59,24; Н 6,50;

Вычислено,%:C 59,13; H 6,59; N 14,59

Б. Получение 1.еа — A.rq — Рго — Phe—

Р е Ту . мЦ

B 20 мл уксусной кислоты растворяют

5 мг защищеннэгэ пептида Š— 1.еи — Й.ц{ко гР»« Р»,е Т, 1Ц иавливают в присутствии палладисвэй чер= ни в течение 10 ч. Катализатор этфильтрэвывают и филътрат концентрируют досуха при пониженном давле пл. Остаток раство= ряют в 5 мл воды и хрэматэграфнруер=. На колонке (2,6х2Осм), занэлненнэй карбокг силметилцеллюлэзэй. Градиентную элюцию проводят с использованием 0,005 и О," А водных растворов анетата аммония (пэ

70О мл каждого раствора). Целевой продукт выхэдит из колонки вэ фракциях от

700 дэ 790 мл. Фракции объединяют и

4 лиэфилизируют В итоге получают 300 мг (63,6% эт теэретическэгэ) белого пушистогэ прэдукта; Й. j -58,3о (c = 0,59%, Ъ вода).

Найдено,%: С 57,72, Н 7,24; N14,25

Вычислено,%: С 5 7,8 1; H 7,28; N 14,05

Аминэкнслэтный анализ: Агg 1,07;7>о

1,03; Т г 0,87; Phe 2,07," Мо 1,00 (содержание педтида 8З,9%).

Пример 13. Получение p — Ata —

Дуц — Phе — Phе — Рhe — Туг — NH .

Л. Пэлучение Z — ф — Ala — КГ (NQ<)— — &be — РЬ е — P h е — Т т(ЬП)-смолы.

В реактор твердэфазнэгэ пентиднэгэ синтезатора загружают 4,33 г ВОС-ТУ (Ы1)

-смолы (содержание тирэзина 2,18 ммэль), дают ей набухнуть и дихлэрметане, вводят в указанном пэоядке БОС- РЬ -ОН, ВОС- @» (ц1пм,», э,s „, э. э 1э .1,, 1

Л Занапт-:)С,— !à Н, Г:-:;,-,†.,:;, ; ;(-;. ПП

« . »,,- э,. (О «я QY теоретическ - гэ/ 4 (с =- 0,46%, вода).

Аминэкисл 1ный анаппз: ЬРЯ » .*»О; 1 "Г

0 8 1 c pf) r„. —; - -: ° ", — /! P L<- !; c» :;эдержа=t -! ние пепт ч 84, 8 ";. j .A. Получение — у — А(» -- -:=: { Гаь»вЂ”

- Le@ — Р»-e — Р 1e — ."УГ ВЫ {» — <:(=--". ": !»

B эеактэр тверд (pç:! oã. пе".т, . . Ного снн и мерцают 4,0 г ВО..- C-, ч =-.с::1,, *. :.! жашей 1,7 ";... .çль глиц и-;л), дают ей на-. бухк =1ь в мет:иенхлэрнде в тече!п!е 0 ч

ВОС- Phe Н, BC Рг„=- =ОH Г,С = .:а—

-Ог1, Аэс "А о (To<.) )Н и 7-I.- 4{ -0Н, используя B Kà!!ecTBc,.эллен нэ юн,егэ аген19 та ДЦГЕДИ, а в качестве агента для от= щепления ВОС-защитной группы — смесь трифторуксусной кислоты с метиленхлоридом в соотношении 1:1. После завершения всех стадий твердофазного синтеза смолу промывают метиленхлоридом, ДМФ, метанолом, ледяной уксусной кислотой, снова метанолом и c GT .до постоянного Весе.

Выход пептидсодержащей смолы 5,09 r.

B. Получение Š— „6 — АЗΠ— А»р = (1 о ) — 1.еп — Phe — Phe — Туг (ВУ() — Q (у — ЯЦ, В 50 мл 17%-ного раствора аммиака в метаноле суспендируют 4,4ã пептидсодержаией смолы, полученной в примере А, суспензщо цомещают в ампулу, герметично ее зацаивавэт. В таком виде суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 48 ч. Смолу отфильтровывают и промывают ДМФ. Фильтраты объединяют и концентрируют досуха1при пониженном давлении. K цолученному в остатке масгу прибавляют этиловый эфир, порошкообразный продуКТ Отделяют фильтроватием. Выход

950 мг.

C. Получение ф — Иа — Агц — Lee = — И е — РЬ е — Туг — Иу — ИНя, Смесь из 500 мг сырого защищенного пептид-амида, полученного в примере Б, 0,5 мл анизола: прибавляют к 10 мл фтористого водорода. Смесь перемешивают при 3О

0ОС в течение 60 мин, фтористый водород отгоняют в вакууме. Остаток растворяют а

50 мл воды, Раствор промывают дважды

20 мл этилового эфира, затем .пропускают через колонку (1 х 10 см) с Амберлит 35 .ЖА -410 в ацетатной форме и лиофилиG v. Лиофилизованный продукт растворяют в 20 мл и раствор вводят в колонку (2s6 х 25 см), заполненную карбоксимЫил. целлюлозой. Злюцию осуществляют градиен- 40 тным методом с использованием 0,005 и

0,2 М водных растворов ацетата аммония (по 800 мл каждого раствора). Фракции элюата от 1200 до 1530,мл объединяют и лиофилизуют, Получают 167 мг белого 45 гз

2 пушистого продукта; j+) -28,93о (с =

= 06%; вода), Найдено,%: С 54,64; Н 7,58; N 14,37

Вычислено, %:С 54,64, Н 7,26; N 14,60 50

Аминокислотный анализ:. A g 1,06; GL 9

1,00; "«1,11; Т г 0,87; РИе 2,09;

А<>1,14 (содержание пептида 82,0%) .

П р и ьл е р 15. Получение P — Ata— — Лго — Зе» вЂ” Phe — Phe — Tye — G tq — NH<

А. Получение Я вЂ”,й — АЬ вЂ” Aeg (ТОЗ)-Ser (SZr) — Phe--Phe -- T r (ВУ1) — G(y --смоль .

В реактор твердофазногo пептидного синтезатора загружают 4,02 r ВСС- (j -Ó -смолы (содержащей 2,17 ммоль глици а) и

2О вводят в указанной последовательности следующие карбоксильные компоненты; BOC"Ts l (B X 1 ) ОН, ВОС- P he -ОН, ВОС— Phe-GH, ВОС- бе»(37.1)-ОН, Аос- At g. (To &)-ОН и, -P -ДЫ- ОН, осуществляя наращивание пептидной цепи по методу Мерифильда. После завершения всех стадий твердофазного синтеза смолу промывают метиленхлоридом, метанолом, ДМФ, ледяной уксусной кислотой, снова метанолом и сушат. Выход пептидсодержащей смолы 6,4», Б. Получение F — P — Ию — Apg (Toe)—

-йег(ВЛ) =Phe -Ph „— - т » д Ц вЂ” а у — (Н, В 50 мл 17%-ного раствора аммиака в метаноле суспендируют 5,9 г пецтидсодержащей смолы, полученной .в примере А, и суспензию перемешивают при комнатной температуре в ечение 48 ч. Смолу отфильтровывают и промывают ДМФ. Промывные воды объедки пот с фильтратом и полученный объединенный раствор упаривают досуха при пониженном давлении. К остатку прибавляют этиловый эфир, а осадок отфильтровывают. Выход продукта 2,02 r.

С. Получение 6 — А(а — Aeg — Зег— — Ph e — Phe — Ty r — Жу — И