Способ получения рифамицина р, , и

Способ получения рифамицина р, , и

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПИ

ИЗОБ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 578014 (61) Дополнительн (22) Заявлено 28,0 (23) Приоритет (31) 3791 3/74 (51) M. Кл.

С 12 g 9/00

Государственный комитет

Совете Инниотроо СССР по делам нзооретеннй и открытий (43) Опубликован (53) У.ДК 615,779..931 (088.8) (45) Дата опубл

Иностранцы

72 Авто ы

Ричард Уайт (Великобритания), джанкарло Ланчини изобретения и Пьеро Антонини (Италия ) Иностранная фирма Группо Лепетит С.п.А (Италия) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИФАМИБИНА Р, С, g и М

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиков.

Предлагаемый антибиотик и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение рифамицина P, Q,, g и Ц

Это достигается тем, что штамм Npcardia mediterraneaATCC 31064 (П-2) или )p

Nocarct i a mediterr area Лт С С 3106 5 (ММ-18-6), или )йосатйа mediterrarlea ОТСС

31066 (М-36 ) выращивают в аэробных условиях при температуре 25-37оС на питательной среде, содержащей источники угле- ) рода, азота и минеральные соли при рН 6,48,5, затем из ферментационной среды выделяют комплекс целевого продукта и разделяют его на отдельные компоненты Р, 4

К и 20

Мутантные штаммы Npcardia mediterranea

АТСС 31064 (jl;2), Nocardia mediterranea

А ГСС 31065 (ММ-18-6) и Nocardia medi1еггапеа АТОС 31066 (M-36) получают обработкой АТС(. ) 3685 азотистой кислотой и производными нитрозогуанидинов в качестве мутагенных агентов или облучением рентгеновскими лучами или ультрафиолетовым светом.

Эти штаммы депонированы в коллекции

АТСС и определены в качестве Носат-с(< а

etediтет апеа АТСС 31064-31066.

Культурально-морфологические признаки.

Штамм АТСС 31064 (Д;2) — колонии конически-воронкообразные, закатанные, диаметр 2-3 мм, красновато-коричневые с охровым растворимым пигментом. Воздушный мицелий слегка серовато-розовый, разветвленный диаметр 0,6-0,8 ммк. Споры цилиндрические 0,8-1 ммк.

Агар с овсяной мукой, обильный рост со слабо складчатой поверхностью, цвет лесного ореха с оранжевыми краями, розово-бежевый растворимый пигмент.

Глюкозо-аспарагиновый агар. Обильный рост с гладкой поверхностью, оранжевый, светло-желтый растворимый пигмент.

Глюкозный агар по Эмерсону. Обильный рост с очень складчатой и покрытой корой

5 (8014

Крахмальный агар (среда № 4). Умеренный рост с гладкой поверхностью, глубокооранжевый, следы соломенно-желтого раствоповерхн(/стью, кирпичного цвета, янтарно- римого пигменте, крахмальный гидропиз: отжептый растворимый пигмент. рицвтельный.

Питательный агар. Умеренный агар с глад. Физиолого-биологические признаки. Желакой и тонкой поверхностью, светло-оранже- тин гидропиэует, нитрвтную среду не восставый. > навпивеет, лакмусовое молоко не коагулируЛгар Придхэма. Умеренный рост с глад- ет и не пектониэирует, крахмал малат кальция, кой и тонкой поверхностью, янтарно-желтый, нитрвты не гидрилизует. слабо розовато-оранжевый воздушный мице- Усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, лий, розоватый растворимый пигмент. мвннозу, фруктозу, пактозу, сахарозу, рамКрахмепьны и агар (среда ¹ 4) ° умерен- 0 позу, р аффинозу, м анни т глицин, инулин, м епьный рост с гладкой поверхностью, оранжевь/Й, тозу, галактозу, глицерин. обильный воздушный мицелий, розовый, о(,(ипь- Не усваивает инозит, салицин, сукцинат ное образование спор, желтый растворимый натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, дудит, пигмент, крахмальный гидролиз: отрицетель- целлюлозу. ны й. Культурально-морфологические признаки.

Физиолого-биологические признаки, (ядро- Штамм АТСС 31066 (М-36). Колонии колиэует жепетин, тирозин, казеин, малат калы- нически-воронкообразные, закетаннь1е, диация, не гидролиэует крахмал, нитраты,,Пек- метр 2-3 мм, оранжево-коричневые с янтармусовое молоко не коагулирует и не пекто- но-желтым растворимым пигментом. Воздушнизирует. Нитратную среду не восстанавли- р0 ный мицелий розовый до розово-оранжевого, вает. Усваивает арабинозу, ксилозу, глюко- разветвленный, диеметр 0,6-0,8 ммк, спозу, маннозу, фруктозу, лвктозу, сахарозу, ры цилиндрические 0,8-1 ммк. иноэит, ремнозу, салицин, маннит, гпицин, Агар с овсяной мукой обильный рост с инулин, мапьтозу, галектоэу, глицерин. гладкой поверхностью, темно-янтарно-желНе усваивает рвффинозу, сорбит, сукци- д тый, следы розового воздушного мицелия, нат натрия, цитрат натрия, ацетат нетрия, темно-янтарно-желтый растворимый пигмент. дульцит, целлюлозу. Агар Чапека-вуокса. Обильный рост с глад

Штамм ATCC 31065 (ММ-18-6) — это кой поверхностью, оранжево-розовый, обильколонии конически — воронкообразные, зека- ный воздушный мицелий, розово-оранжевый, танные, диаметр 2- 3 мм, глубокооранже- З0 следы светло-желтого растворимого пигменвый с темно-оранжево-желтым растворимым та. пигментом. Воздушный мицелий розовый до Глюкозо-аспарагиновый агар. Очень хоросветло-оранжевого, разветвленный, диаметр ший рост, золотистый, нет растворимого пиг0,6-0,8 ммк. Споры цилиндрические 0,8мента.

1 ммк. 35 Гпюкозный агар по Эмерсону. Обильный

Агар с овсяной мукой. Обильный,.:ост с рост со складчатой поверхностью, темно-янгладкой поверхностью, оранжевый, сп ды ро- терно-желтый, темно-янтарно-желтый пиг. зового воздушного мицелия, мало спор, ро- мент. зово-бежевый растворимый пигмент. Питательный агар. Очень хороший рост с

Агар Чапека(-вуокса. Рост хороший с глад-щ тонкой и гладкой поверхностью, оранжевый, кой поверхностью, оранжевый, светло-оран- нет растворимого пигмента. жевый воздушный мицелий. Агар Придхэма, Обильный рост, слегка

Глюкозо-аспарагиновый агар. Очень сла- покрытый корой, янтарно-коричневый, следы бый рост с гладкой поверхностью, светло- розоватого воздушного мицелия, янтарно-кооранжевый, нет растворимого пигмента. Глю- 45 ричневый растворимый пигмент. козный агар по Эмерсону. Обильный рост с Крахмальный агар (среда № 4). Обильочень складчатой и покрытой корой поверх- ный рост с гладкой поверхностью, оранж ностью, кирпичного цвета, янтарно-желтый вый, следы розового воздушного мицелия, растворимый пигмент. светло-желтый растворимый пигмент, крахПитательный агар, умеренный рост со so мапьный гидролиз: отрицательный. складчатой и тонкой поверхностью, светло- Физиолого-биологические признаки. оранжевый, нет растворимого пигмента. Желатин, казеин, тирозин гидропизует, /

АгаР ПРидхэма. Обильный Рост с гладкой кр™", малат кальция, нитраты не гидр поверхностью, кирпичного цвета, розовый воз- лизует, нитратную среду не восствйавливает, дуовный мицепий желтый растворимый пиг- 55 лекмусовое молоко не ковгулирует и не пенмент. т онизирует.

Усваивает арабинозу, ксипозу, глюкозу, манноэу, фруктозу, лактоэу, сахерозу, инозит, рамнозу, свлицин, маннит, глицин, мельтозу, галактозу, глицерин.

578014.Не усваивает раффинозу, сорбит, сукцинат, натрия, цитрат натрия, апетат натрия, инулин, дуцит, целлюлозу.

Выращивают штаммы на питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода и азота до тех пор, пока в питательной среде не будет доказано наличие значительного количества рифамицина, после чего экстрагируют. Выращивание проводят при перемешивании и глубокой аэрации пита-10 о тельной среды при температуре 25-37 С (предпочтительно при 28оС).

В качестве источников углерода применяют глюкозу, гапактозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, глицерин, маннит, Подходящими источниками азота являются, например, аминокислоты и их смеси, пектиды, протеины и их гидролиэаты, например пелтон, дрожжевой экстракт, мука соевых бобов, полученная вымачиванием кукурузы в воде, рыбная мука, мясные экстракты и водные фракции из хлебных семян. Ферментация длится 180-200 час, причем величина рН в начале 6,4-6>6) к концу повышается до 7,0-8,5.

После окончания ферментации рифамицины выделяют следующим образом, Ферментационную среду отфильтровывают при рН 7,0-8,5, фильтрат быстро подкисляют (предпочтительно при величине рН ниже

5 для обеспечения стабильности антибиотиков). После этого их экстрагируют не смешивающимся с водой растворителем, например хлороформом, бутанолом> этилпропил-, бутил- или амипацетатом, цричем,объемное соотношение среды к растворителю в зависимости от растворителя составляет от 2:1 до 10:1.

0стаюшееся в мицелии количество антибиотиков экстрагируют не смешивающимся с водой растворителем и потом соединяют с орагнической фазой, содержащей главную дошо рифамицинов, но можно также экстрагировать смешивающимся с водой растворите45 лем, например ацетоном. В этом случае жидкость отфильтровывают, а ацетон выпаривают в вакууме. После этого рифамицины экст рагируют не смешиваюшимся с водой раст» ворителем.

5Q

После перевода антибиотиков в растворенный вид выпаривают раствор в вакууме до- . суха предпочтительно при температуре нйже

30оС.

Сырой экстракт рифамицинов очищают хро-, матографическп на колонке силикагеля. Перед хроматографией растворяют экстракт в фосфатном буфере при рН .7,0-8,0 и затем обрабатывают слабым окислитепем. Буферный раствор потом экстрагируют не смешиваюшимся с водой растворителем,Экстракт содержит новый рифамицин К .

Экстрагированный буферный раствор подкисляют до рН 2-4 и потом снова его экстрагируют указанным выше образом. Экстракт содержит новые рифамицины g, 4 и 9;

Йальнейшую очистку новых рифамицинов .проводят хроматографическим путем на колонке, содержащей подходящий адсорбент, например силикагель, с подходящей смесью растворителей в ачестве элюента.

П р и м е p L. Мутантный штамм Mocard(a meditcrra ee АТСС 81064 выращивают в течение 6-8 дней на агаре Беннета при температуре 28 С. Полученной скошенной о культурой при стерильных условиях инкубируют две колбы Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащие 100 мл гетативной среды следующего состава, г:

Экстракт говядины 5

Дрожжевой экстракт 5

Пептон 5

Гидролизат каэеина: 3

Глюкоза 2О

NnCf 1,5

Н 0 El,o 1л

Величину рН при помощи раствора едкого натра доводят до 7;3. Колбы в течение

72 час выдерживают на качалке, после чего инкубируют предварительный возбуди ель брожения емкостью 10 л, содержащий 4 л указанной вегетативной среды. Затем выращива- . ние осуществляют при аэрации, температуфе

28оС и перемешивании при 300 об/мин.

После 48 час получают 7-10%, плотно укомплектованных. клеток. Затем используют стеклянный бродильный резервуар емкостью

10 л, содержащий Q n ферментационной жидкости следующего состава, r:

Арахисовая мука 25

Мука иэ соевых бобов 5 (й Н>,) 504 9,5

Глюкоза 95

Глицерин 40

КН2.PO„ 1

Пропиленгликоль 5

СаСО 8,5 иэтилбарбитурат натрия 1,7 и 604 5H 0 2,8

Я 80>> ° 7йд 0 8 5 х 0„7Н,О 42,5

Мп&О„Нд 0 3,4

СаС 2 6830 1,7 (NH>>)>>»>о7,oé,4„ 0,85

Н 0 Qo 1 л

Величину рН доводят до 7,8 при помощи раствора едкого патра. Затем стерипизуют

60 мин при температуре 120оС, после чего рН доводят до 6 4, Для инкубации прцме57801 4

6 о

0,85

7 няют количество предварительного возбудителя брожения, соответствующее 59о-ному содержанию бродильного резервуара.

Ферментацию проводят при температуре

28 С при аэрации с перемешиванием при о

750 об/мин. В качестве антивспенивателя применяют силикон А, Культурвльная жидкость в ходе ферментации приобретает характерный красно-бурый цвет. После 200 чвс получают определенный объем плотно уком o плектованных клеток. Если рН составляет

7,5, то культуру снимают.

Пример 2. Культуру Иосагйа mediterranea АТСС 31064 получают, как в примере 1, и выращивают в колбе на ка- 1 чалке. Для получения предварительной культуры ийкубируют стеклянный бродильный резервуар емкостью 10 л, содержащий 4 л среды следующего состава, r: .

Глюкоза 5 20

Арахисовая мука 7,5

СаСО 1,65 м ьа „7н,с

0,33 H2 l O4 0,33

Fe SOq 7Н О 393 25

Хп SOq ° VHg0 16,5

МпбО» 4H 0 1,3

Н„Р

go1л

Величину рН доводят до 7 5 Затем стерилизуют в течение 50 мин при 120оС, пос-30 ле чего величину рН доводят до 6,4. После

48 час плотно укомплектованные клетки составляют 6-87 общего объема. При помощи

10/о-ного инокулума инкубируют стеклянный бродильный: резервуар емкостью 20 л,„содер- 5 жащий ферментационну:о среду следующего состава, r:

Кукурузная жидкость

Мука из соевых бобов (Мн ) 50

Мд ЬОИ 7Hz0

Глюкоза

КН PO

6

Ге Ь0„7Н,0 8,5

Хп 60 7Н О 42,5

Мп S0 4HдО 3,4

Си 50„5H 0 2,8

Со СЕ, ВН,0 1,7

Н 0,Бо 1 л

Величину рН доводят до 7,8 при помощи раствора едкого натра. После этого стерилизуют 50 мин при температуре 120 С, после чего рН доводят до 6,4. Ферментвция проходит при 28оC в течение 200 час. При рН

7,5 культуру снимают.

Полученные по примерам 1 и 2ферментационные жидкости счищают следующим образом.

Мицепий отфильтровывают и выбрасывают, рН фильтрата доводят до 2,0 при лом щи 10"6-ной соляной KHcTIoTbl и экстрагируют три раза, применяя одинаковое количество этилацетата. Органический экстракт выпаривают в вакууме досуха при температуре

35 С. Остаток (4 г из примера 1 и 11, г из примера 2) растворяют в 0,005 М буфере фосфатв натрия при рН 7;5, после чего прибавляют NaNO до конечной концентрации

0,27. После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре экстрагируют буферный раствор три раза, применяя одинаковое количество этилацетата. Соединенные органические экстракты выпаривают в вакууме досуха при 35оС (первый экстракт этипацетат). рН отсосанного буферного раствора доводят до 2;0 при помощи 10%-ной соляной кислоты и экстрагируют три раза, применяя одинаковое количество этилацетата. Хл единенные органические экстракты выпаоиввют досуха прй - 35оС (второй экстракт этилацетата).

Сухой порошок первого экстракта этилацетата (1,4 г из примера 1 и 4,2 г из примера 2) растворяют в хлороформе и хроматографируют на колонке силикагеля. B качестве первого главного продукта из колонки элюируют рифамицин й, который можно узнать по оранжево-коричневому цвету.

Согласно тонкослойной хроматограмме с цластинками силиквгеля с хлороформом, метиповым спиртом в качестве системы растворителей (95:5) для рифамицина Я,,1Ц

0,59. Фракции, содержащие рифамицин Я, соединяют, выпаривают в вакууме досуха при 35оС, растворяют в этилацетате и промывают 0,01 н соляной кислотой и затем водой. Органический экстракт концентрируют и рифамицин R при температуре 4 С выкристаллизовывают из раствора (600 мг по примеру 1 и 1,6 г по примеру 2). Второй экстракт этилацетата хромвтогрвфируют нв колонке силиквгеля, как и рифамицин g. Сухой остаток (2,4 г по примеру 1 и 4,2 г по примеру 2) растворяют в хлороформе и. наносят-на колонку силикагеля.

Колонку элюируют при помощи смеси хлороформа и метилового спирта (98:2). СначаВВ получают рифамицин О, потом рифамиш1и R и рифамицин 6 . Все три компонента являются желто-оранжевыми в промывном растворе и их можно определить тонкослойной хроматографией.

Значения R составляют рафвмицин

0,63, рифамицин P — 0,57, рифамицин Я—

0,32, Фракции, содержащие рифвмицины Ц, Р и 4 соединяют, выпаривают в вакууме досуха и кристаллпзуют из этипацегата. llo примеру 1 получают 80 г рифамипина U, 9

578014

400 мг рифамицина P и 280 мг рифамицина Ц, а по примеру 2 - 190, 900 и 750 мг.

При использовании штаммов Nocardia

mediterranea АТСС 31065 и 31066 получают а налогичные выходы рифамицинов U, Ри4.

Формула изобретения

1, Способ получения рифамицина Р, Q 10 йн U отличающийся темчто штамм NOcardia тейлор.гапее АТСС

31064 (Д;2), или Косогора rneditterranea

ATCC 31065 (ММ-18-6) или Nocardia

mediterranea АТСС 31066 (М-36) вы- 1к ращивают в аэробных условиях при темпера)0 туре 25-37 С на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при рН 6,4-8 5, затем из ферментационной среды выделяют комплекс целевого продукта и разделяют его на отдельные компоненты Р, й,, К, и О.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что, рифамицин выделяют из ферментационной среды экстракцией не смешиваюшимся с водой растворителем при рН ниже 5, 3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю ш и й-. с я тем, что комплекс целевого продукта разделяют на отдельные компоненты хроматографией на колонке.

Составитель С, Малютина

Редактор А, Бер Техред И. Гоксич Корректор С. Шекмар

Заказ 3254/55 Тираж 541 Подписное

UHHHHH Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4