Способ получения вещества рейхштейна и его производных

Способ получения вещества рейхштейна и его производных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е (1ц 578334

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

LoI03 0088TcKNx

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 19.05.76 (21) 2361418/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.10.77. Бюллетень № 40 (45) Дата опубликования описания 03.11.77 (51) М. Кл.z С 12D 13/06

А 61К 37/24

Государственный комитет

Совета Мнннстров СССР но делам изобретений и открытий (53) УДК 615.45:615.361. .34 (088.8) (72) Авторы изобретения

А. Н. Коняхин, В. И. Тропина, В. Н. Васильев, Н. В. Домрачев, Б. И. Демченко, В. Г. Воронин, И. И. Тюляев и В. П. Краснов

Филиал Всесоюзного научно-исследовательского химикофармацевтического института им. С. Орджоникидзе (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА $ РЕЙХШТЕЙНА И ЕГО

ПРОИЗВОДНЫХ

2,46

Изобретение относится к получению гормональных препаратов.

Известен способ получения вещества S

Рейхштейна путем выращивания штамма

Corynebacterium mediolanum Р/383, внесения полученной трансформирующей культуры и исходного стероида в питательную среду для трансформации с последующим выделением целевого продукта.

Однако известный способ не обеспечивает интенсификации процесса.

С целью интенсификации процесса используют трансформирующую культуру в ранней фазе логарифмического роста, а исходный стероид вносят однократно. Кроме того, исходный стероид вносят или одновременно с трансформирующей культурой, или в течение первых двух часов после внесения трансформирующей культуры. При этом исходный стероид вносят в количестве не более 25 г/л среды.

Способ осуществляют следующим образом.

Специально подготовленный мелкокристаллический исходный стероид (с размерами кристаллов (<40р) в количестве до 25 г/л в один прием в. осят на трансформацию в соответствующую питательную среду одновременно с посевным материалом, взятым в количестве 7,5 — 15% от объема питательной среды, или в течение первых двух часов после посева культуры Corynebacterium mediolaпшп P/383.

Пример 1. Получение вещества S Рейхштейна из моноацетата вещества R.

Культуру Согупеоас1ег1цгп mediolanum

Р/383 выращивают в течение 30 час при 33"С в пробирках на скошенной агаризованной питательной среде PS следующего состава, r:

11ептон ферментативный 4,5

Дрожжевой экстракт 3,0

Мясопептонный бульон 0,150

Гидролизат казеина сухой 4,0

Глюкоза безводная 1,0

Агар белый вымороженный 30,0

15 Дистиллированная вода До 1,0 рН 6,9 — 7,0

Для получения I генерации культуры делают смыв с поверхности плотной питательной

20 среды PS 5 мл физиологического раствора и

0,5 мл полученной суспензии засевают 50 мл жидкой питательной среды СМ/6, находящейся в конических колбах емкостью 250 мл.

Среда СМ/6 имеет следующий состав, г:

25 Дрожжевой автолизат 6,0

Глюкоза безводная 3,0

Калий фосфорнокислый двузамещенный

Натрий фосфорнокислый

30 двузамещенный 4,0

578334

Натрий хлористый

Вода питьевая рн 7,3 — 7,4

2,0

До 1,0

Культуру 1 генерации выращивают в течение 24 час при 28"C на круговой качалке с 120 об/мин. 1 генерация кулыуры является посевным материалом для подготовки II генерации Con nebacterium mediolanum P/383.

Культуру 11 генерации выращивают в 25литровом стеклянном ферментере с рабочей емкостью 8 л на среде СМ/6. Ферментер со средой стерилизуют в течение 20 мин при

120 С. Посевнои материал стерильно переносят в ферментер в количестве 0,6% от объема питательной среды в ферментере. Культуру 11 генерации выращивают в течение 24 час при перемешивании со скоростью 500 ooj

/мин, аэрации 0,7 л/л в мин, температчпе

33 С, Трансформацию моноацетата вещества в вещество S Рейхштейна приводят в 25-литровом стеклянном ферментере с 8 л питательной среды следующего состава, г:

Дрожжевой экстракт 2 о

1-1 атрий фосфорнокпслый двузамещенный 4,5

Калий фосфорнокпслый однозамещенный 1,0

Вода питьевая До 1,0 рН 7,0 — 7,1

В ферментер со средой ВК/4 — 1 вносят культуру П генерации в количестве 7,5 — 15% от объема питательной среды. Одновременно с посевом культуры или в течение первых двух часов после посева в фермептер вносят

200 г (25 г/л) специально подготовленного мелкокристаллического моноацетата вещества R (с размерами кристаллов (40p) в виде водной суспензии. Трансформацию проводят в течение 24 час при перемешивании со скоростью 800 об/мин, аэрации 0,2 л/л в мин, температуре 33 С, рН 7,0 — 8,2 (без доведения), В качестве пеногасителя применяют антифомсилан, Контроль процесса трансформации осуществляют с использованием метода тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol

U V — 254.

По окончании трансформации выделяют вещество S Рейхштейна из культурной жидкости трехкратной экстракциеи этилацетатом по 20 л. Этот экстракт упаривают в вакуу.»е при 50 С до 1,5 л.

Из упаренного экстракта после б-часовой выдержки при 5 С отделяют фильтрацией выделившееся вещество 5 Реихштейна и сушат в вакууме при 60 С в течение 6 час. Получают 132 г вещества S Рейхштейна. Маточный раствор повторно упаривгют в вакууме до

150 мл и аналогично первому кристаллизату выделяют дополнительно 16,5 г вещества S

Рейхштейна. Продукт прпсоединя|от к основному веществу. Маточный раствор упярпвают досуха, продукт суспендируют в 50 мл этилового эфира и после отделения получают дополнительно 0,75 r вещества S Рейхштейна.

Всего выделяют вещества S Рейхштейна

149,25 г (74,63% от загруженного моноацетата вещества R) со следующими константами: температура плавления 206 — 207 С, удельное вращение (а) Ю вЂ” " (С 1, хлороформ), удельное поглощение в УФ,Š— 470 при Х„„„.ñ 241 — 242 пм.

Пример 2. Получение 4-прегнен-1 ба-метил-17сс,21-диокси-3,20-диона (I ба-метил вещества S Рейхштейна) из 5-прегнен- 1 бс.-метил-21-ацетат-36,17а,21-триол-20-она (l ба-метил моноацетата вещества R) .

15 Культуру Согуnebacterium mediolanum

Р/383 выращивают на среде PS аналогично примеру 1.

Для получения культуры 1 генерации делают смыв с поверхности среды PS 5 мл

20 физиологического раствора и 0,5 мл полученной суспензии засевают 50 мл питательной среды СМ/б, находящейся в конических колбах емкостью 250 мл. Состав среды СМ/6 приведен в примере 1.

25 Культуру 1 генерации выращивают в течение 24 час при 28 С на круговой качалке с 240 oo/ìèí. Культура 1 генерации в количестве 0,6% от объема питательной среды является посевным материалом для подготовки

30 II генерации культуры.

Культуру 11 генерации выращивают в 250миллилитровых конических колбах с 50 мл питательной среды СМ/6 в течение 24 час при 28 С на круговой качалке с 240 об/мин.

35 Трансформацию 1 ба-метил моноацетата вещества R в 16и-метил вещество S Рейхштейна проводят в 2о0-миллилитровых конических колбах с 50 мл питательной среды

ВК/4 — 2 следующего состава, г:

40 Дрожжевой автолизат 5,0

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 4,5

Калий фосфорнокислый однозаменный 1,0

45 Вода питьевая ГОСТ 2874-73 До 1,0 рН 7,1 — 7,2

В колбу со средой ВК/4 — 2 вносят 7,5% (от объема питательной среды) культуры 11 генерации. Одновременно с посевным материалом вносят 500 мг (10 г/л) специально подготовленного мелкокристаллического стероида (с размерами кристаллов (40 ) в виде водной суспензии и проводят трансформацию в течение 16 час при 28 С на круговой качал55 ке с 240 oo/мин.

Контроль процесса и определение количественного выхода 16-метил вещества S Рейхштейна осуществляют с использованием методов тонкослойной хроматографии на пла00 стива S lufoi UV — 254 и спектрофотометрировапия полученных элюатов пятен с пластинок.

Выход конечного продукта составляет

87,7% от загруженного 1 ба-метил моноацета65 та вещества /, 578334

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Техред Л. Гладкова

Редактор М. Дмитриева

Корректоры: Е. Хмелева и А. Степанова

Заказ 2455/1 Изд. ¹ 893 Тираж 563 Подписнос

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7Ê-35, Раушская наб., д. 4,5

Типография, пр. Сапунова, 2

Применение предлагаемого способа позволяет без изменения аппаратурного оформления процесса, на тех же питательных средах готовить более активную культуру, способную без снижения выхода конечного продукта трансформировать пятикратное количество стероида, внесенного в один прием в трансформационную среду, т. е. отпадает необходимость его дробной загрузки, что уменьшает трудоемкость процесса. 3а счет совмещения двух стадий (подготовки трансформирующей культуры и процесса трансформации), приводящего к сокращению длительности процесса на 14 — 20 час, увеличения нагрузки исходного стероида до 25 г/л значительно сокращаются энергозатраты, расход сырья на приготовление питательных сред и повышается экономическая эффективность процесса.

1. Способ получения вещества S Рейхштейна и его производных путем выращивания штамма Corynebacterium mediolanum P/383, внесения полученной трансформирующей культуры и исходного стероида в питательную среду для трансформации с последующим выделением целевого продукта, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью интенсификации процесса, используют трансформирующую культуру в ранней фазе логарифмического роста, а исходный стероид вносят од1О нократно.

2. Способ по и. 1, отл и ч а ю щи и ся тем, что исходный стероид вносят одновременно с трансформирующей культурой.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что исходный стероид вносят в течение первых двух часов после внесения трансформирующейй кул ьту р ы.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что исходный стероид вносят в количестве не более 25 г/л среды.