Способ получения лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы

Способ получения лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1111 578335

ОПИСА Е

ИЗОБРЕТЕН И Я

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Реснублик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 23.02.76 (21) 2326556, 28-13 (51) М. Кл. - С 128 13 10 с присоединением заявки ¹

Государственный комитет

Совета Министров СССР по денем изобретений и открытий (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.10.77. Бюллетень ¹ 40 (45) Дата опубликования описаш|я 03.11.77 (53) УДК 577.15.663.1 (088.8) (72) Авторы изобретения

А. С. Цыперович, Л. А. Коноплич и М. В. Колодзейская

Институт биохимии им. А. В, Палладина (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙЦИЛ-ГЛИЦИЛ-ГЛИЦИНАМИ НОП ЕПТИДАЗЫ

Изобретение относится к области технической микробиологии и может быть использовано для получения ферментных препаратов, в частности пептидаз из микробиологического сырья.

Известен способ получения лейцил-глицилглицин-аминопептидазы, предусматривающий осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Aspergillus, обессоливание белковой фракции, фракционирование белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализ пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизацию в фосфатном буфере.

Однако используемые в известном способе в качестве ферментного сырья штаммы Aspergillus oryzae u aspergillus paraziticus продуцируют токсины, от которых не удается освободиться на последующих этапах очистки.

Цель изобретения — получение фермента, свободного от токсичных примесей, и повышение его стабильности.

Для этого осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода AspeIgillus, проводят в присутствии ионов кобальта, перед диализом осуществляют инактивацию протеин азы, а лиофил из ацию проводят при рН 7,8 — 8,0. При этом протеиназу инактивируют нагревом в течение 10 — 15 мин до

62 С с последующим охлаждением до 20 С.

Сущность предлагаемого способа заключается в обработке ферментного сырья из штамма Aspcrgilius, осаждении белков сульфатом аммония, обессолпванпп белкового осадка, фракционированпп белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализе пептидазной фракции с Bûäåëcнпем целевого продукта и его лиофилизации в фосфатном буфере.

Концентрированный препарат повер«ностной

10 культуры Aspergillus flatus растворяют в воде с добавлением 0,001 — 0,0001 М раствора

«лористого кобальта, осаждают нпзкомолекулярные белковые примеси этанолом. В полученной после дробного осаждения и цент15 рифугирования ферментной фракции инактивируют протеиназу нагревом в течение 10—

15 мин, обеспечивая перепад температур от

62 до 20 С, а очищенную лейцил-глицил-глицин-аминопептидазу лиофилизуют из кобальт20 содержащего раствора при рН 7,8 — 8,0.

П р и и е р. 100 г концентрированного препарата поверхностной культуры Aspergillus

il avus — флавизина, полученного Украинским научно-исследовательским институтом

25 пищевой промышленности, обрабатывают семикратным объемом воды, содержащей ионы

Со+, в течение 2 час для извлечения низкомолекулярны«веществ и други«примесей.

Смесь центрифугируют в течение 40 мин при

3О 3000 об/мин. Полученный раствор, содержа578335

Формула изобретения

Составитель Т. Серебренникова

Texpeд Л. Гладкова Корректоры: E. Хмелева и А. Степанова

Редактор М. Дмитриева

Заказ 2455/2 Изд. Ко 893 Тираж 563 Подписное

kIIIO Государственного

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4t5

Типография, пр. Сапунова, 2 щий пигменты, примеси углеводородов, протеазы и пептидазы, охлаждают до 2 С и прибавляют этиловый спирт до конечной концентрации 50 /, при температуре — 8 С. Выдерживают систему в течение 20 мин, а затем центрифугируют на холоде.

Полученный белковый осадок, содержащий протеазы и пептидазы с примесью углеводов и пигмента, растворяют в двойном количестве по отношению к исходной навеске флавизина дистиллированной воды, содержащей ионы Со . Нерастворившуюся часть удаляют центрифугированием.

К надосадочной жидкости, содержащей протеазы и пептидазы, прибавляют сухой сульфат аммония до 40% от полного насыщения и выдерживают в течение 15 — 18 час при комнатной температуре. Белок, выпавший в осадок, отделяют центрифугированием, а в полученном растворе проводят повторное насыщение сульфатом аммония до 80 /о от полного насыщения. Через 6 — 8 час смесь центрифугируют, а осадок, содержащий протеины и пептидазы, растворяют в половинном обьеме дистиллированной воды, содержащей ионы Со+ . От сульфата аммония освобождаются диализом против 0,0067 М фосфатного буфера при рН 7,8 — 8,0.

Для инактивации проте1н1азы полученный диализат подогревают до 62 С в течение

10 мин и сразу же охлаждают на водяной бане до 20 С. Денатурированный белок, содержащий пептидазы, удаляют центрифугированием, а пептидазную фракцию очищают на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой при линейном градиенте 0,1 — 0,7 М NaCl в 0,02 М фосфатпом буфере при рН 7,8 — 8,0.

Активную фракцию, полученную после обессоливапия диализом, хроматографируют на сефадексе Г-100 в фосфатном буфере и лиофилизуют из кобальтсодержащего раствора при рН 7,8 — 8,0.

Расчет активности ЛГГ-аминопептидазы проводят по формуле:

Активность лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы = а 1000 10з 100 оо ед., б.c t xy, где а — количество очищенной аминокислоты (в перерасчете по оптической плотности), у;

1000 — перевод у в мг;

10з — перерасчет до целого числа;

b — молекулярный вес расщепленного пептида; с — навеска фермента, у;

/ — время инкубации, мин;

100 — — перерасчет на 1 мг чистого белка; хо, х% — содержание чистого белка в препарате.

Способ позволяет получить высокоочищенпый препарат лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы, гомогенный при электрофорезе в

15 полигкриламидном геле, а также при исследовании его методом экзимэлектрофореза.

Предлагаемый способ позволяет получить препарат ЛГГ-аминопептидазы с активносгью, составляющей 24% по сравнению с активностью концентрированной поверхностной культуры Aspergillus flavus, со степенью очистки в 237 раз и свободный от токсических примесей.

Полученный лиофилизированный ферментный препарат полностью сохраняет исходную активность в течение года при хранении его при 4 С.

1. Способ получения лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы, предусматривающий осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Aspergillus, обессоливание белковой фракции, фракционирование белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализ пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизацию в фосфатном буфере, о т л и ч а ю40 шийся тем, что, с целью получения фермента, свободного от токсичных примесей, и повышения стабильности фермента, осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Aspergillus, проводят в присутствии ионов кобальта, перед диализом осуществляют инактивацию протеиназы, а лиофилизацию проводят при рН 7,8 — 8,0.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что протеиназу инактивируют нагревом в течение 10 — 15 мин до 62 С с последующим охлаждением до 20 С.