Способ получения биомассы

Способ получения биомассы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К llATEHTV

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 57 8901 (б1) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 15.02.73 (21) 1886507/13 (23} Приоритет — (32} 16. 02. 72 (51) М. Кл.

С 12 Ъ 13/06

Гасударственный камнтет

Саветв Мннистрав СССР на делам нзааретеннй н аткрнтнй (33) Великобритания (31) 7074/72 (53) УДК

637.127.3 (088.8) (43) Опубликовано 30.1(177. Бюллетень №40 (45) Дата опубликования описания 15,11.77 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Патрик Гоулд (Великобритания)>

Фрэнсиз Моран (Ирландия) и Филип Альберт Майерс (Великобритания) 1

l

Иностранная фирма

3 ДЗЕ Бритиш Петролеум Компани Лимитед (В ели кобрит ани я ) (7I) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛуЧБНИ Я EHOMACCbl

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биомассы, заключающийся в непрерывном культивировании метанутилизирующих микроорганизмов в жидкой питательной среде, содержащей ассимилируемые источники азота и минеральные соли, в присутствии метановоздушной смеси. При этом связанный азот находится в жидкой питательной среде в виде аммонийных или нитратных солей (11 .

Недостатком известного способа является использование связанного азота в избыточном количестве, превышающем колиЧество, необходимое для .потребления микроорганизмов, что токсично для микроорганизмов, утилизирующих азот и метан.

Цель изобретения — частичная замена связанного азота в форме аммонийных или нитратных солей молекулярным азотом атмосферы или полное исключение иэ среды связанного азота.

Для этого по предлагаемому способу в качестве метанутилиэирующих микро" организмов используют мнкроорганизмее2 из рода Mehhgkococcus, обладающие способностью фиксировать атмосферный азот, в жидкой питательной среде, при этом количество связанного азота в пи5 тательной среде регулируют таким образом,чтобы его уровень в среде в процессе выращивания был меньше того количества, которое содержится в:готовой биомассе.

10 из рода Ме&цГососст>в нспольэуют вид сорьаЕо1из

Биомассу по предлагаемому способу получают путем непрерывного выращивания культуры микроорганизмов нэ рода

15 Ме(йфососсиз вида соры8оМь, утилизирующих метан и атмосферный азот в жидкой питательной среде.

Питательная среда содержнт мннераль20 ные соли, источник связанного азота в форме аммонийных илн ннтратных солей, кроме:тбго> в нее подают катано-воэдущнуя;айат ..При этом связанный. азот может, быть :цолностью исключен нэ сос25 тана: питательной среды нлн его количество должно составлять 95-99% от количества азота, содержащегося в гото.вой биомассе.

Метано-воздушная смесь содержит, 30 об.Ът метан 10-50 (предпочтнтельно 12".-- >8901

-25); ки л рв>д 10, 5 -1 8, 9 (1>рецпо:тительно 16-=) 7); азот -..0-72: та смес.-: M .., IIBT QLITb Обогащена чисTED@ Ii >III но1>о > Yai i . В li < 1е1" 1в e Il ст Q

Культивирование мик1>оорганизм >в и .>онодят lip!i понышенно» давлении, и пример, при 3-4 атм, рП пи атс.льной среды поддерживают 4t5 8>0, Гlредп Зч"и тельно 5.5-7,0, для чего используют щелочь, на>. ример, едкий 1!a Тр.

Температура среды н процессе выращивания находится н пред -лах от 20 д:>

60 С преимущестненно от 35 до 50ОC.

16

Оптимальные условия выращивания обеспечинаются при рН 6,5 и температуре

45 С.

Удельные скорости разбавления составляют от 0,1 до 0,35 ч - при выходе биомассы ст О, 1 до 10 г/л.

Согласно изобретению биомасса мо.>кет быть получена в дне стадии.

В первой стадии (стадия подготовки культуры) выращивают микроорганизмы, утилизирующие молекулярный aýñ>T и ме- @ тан, н жидкой Нтательйой среде, содержащей минеральные соли,.в присутствии источника связанного азота, аммонийных или нитратных солей метана н качестве источника углерода и газа, 30 содержащего свободный кислород. При этом концентрация клеток микроорганизмов составляет от i до 30 г/л.

На второй стадии приготонленную культуру непрерывно выращивают в жид- 35 кой питательной среде, содержащей минеральные соли, источник связанного азота, н присутствии метана и газа, содержащего свободный кислород и молекулярный азот. Количество связанно-,щ

I о азота должно быть меньше того количества, которое- содержится в готовой биомассе. Связанный азот может быть вообще исключен из состава питательной среды, В стадии подготовки выращивание микроорганизмов можно осуществлять как периодически, так и непрерывно.

При непрерывной работе удельная скорость разбавления должна быть значительно меньше, чем максимальная удельная скорость роста микроорганизмов, а концентрация св.яэанного азота — несколько больше: требуюЩейся для обеспе- чения потребления азота мйкроорганизмами — от;.2 до,1.00 Мг/л

Исходной культурой для инокулирования в стадии подготовки может быть культура микроорганизма, утилизирующего азот и метан например культуt

Ю ра на косом срезе arapa. Ферментатор можно также инокулировать пробами веществ, содержащих микроорганизмы, например почвы или грязи.

Если в качестве инокулятора используют пробы вещества, содер>кащего мик- 6ф роорганизмы, то подготовку культуры ведут в две стадии, на первой из которы < из вещества выделяют микроорганизмы, утилизирующие молекулярный азот и метан, а на второй — увеличиBaIoT концентрацию клеток указанных микроорганизмов до концентрации, необходимой в продукционной стадии. Лучший источник азота н этой стадии— нитрат или аммиак.

Пробы вещества, содержащего микроорганизмы, можно добавлять в непрерывно действу>ащую обогатительную систему. Предпочтительным является обогащение н. непрерыннодействующем ферментаторе., содержащем любую вышеописанную жидкую.пйтательную среду с источником азота a ниде нитратных солей, при условиях, -сйбсоф@твующих размножению утилиэирующих молекулярный азот и метан микроорганизмов. .

Скорость разбавления должна быть значительно ниже ожидаемой максимальной скорости роста микроорганизмов.

Оптимальная рабочая температура более

40 >С, скорость разбавления О, 65-0,15 ч.

Пример.

I. Стадия подготовки культуры.

500 мл шлама, содержащего метан грязи из отстойника, добавляют с интервалами в течение 5 дней в аэрируемый ферментатор с 5 л жидкой питательной среды следующего состава, мг/л:

КН,РО„ 1600

М НРО>,-12Н О 2928

Ма МО 1180

VERSO, 7Н,О 80

РеЬО>, 7Н О 14

СО(1 10 ) > 11 Нг0 25

CuSOI, 5Н,О 4

ZnS0I, 7Н О 0,34

/йпЯ) Н О 0,30 йа М О>, 2НрО 0,24

Дистиллйронанной водой доводят о объем до 1 л. Температура 45 С, скорость разбавления 0,084 ч, скорость мешалки ферментатора 1000 об/мин, рН

6,75 создают добавлением 0,5 н. раствора едкого натра.

В ферментатор подают со скоростью

20 об/ч газовую смесь, состоящую иэ

33 об.% метана, 64 об.% воздуха и

3 об.% двуокиси углерода.

Через 7 дней работы при указанных условиях концентрация клеток бактериальной популяции достигает 1,0 г сухого веса на 1 л. Из этой популяции выделяют один штамм бактерий, утилизирующих молекулярный азот и метан; присутствуют в ней и другие типы бактерий, не утилизирующих метан. Соотношение клеток бактерий, утилизирующих метан и молекулярный азот, и клеток бактерий другого типа составляет

90-95% (по количеству) .

Бактерии, утилиэирующие метан и азот, представляют собой капсулооб578901

288 F000

64,000

158,000

204,000 286,000

240,000

219,000

О, 330

2,040

О, 330

63, 700

286s000

157,700 разные кокки с диаметром 1, 1-1, 4 мкм, неспособные утилизировать глюкозу.

На твердой среде, приготонленной путем добавления 1 нес./об. агара к ферментационной среде, после инкубиронания и течение 10 дней при 45 С н атмосфере метан-воздух (50/50 по объему) колонии имеют следующую морфологию .. Диаметр 1 мм, белые, гладкие, округленные. По этим характеристикам они сходны c hhethgtococcuc сорвино us, но н отличие от них они утилиэируют молекулярный азот (как источник азота), метанол и не образуют цист или остаточных стадий.

Стадия развития культуры. Бактерии, утилизирующие азот и метан, полученные в фазе выделения, выращивают при 45 С Н 5,0 л питательной среды следующего состава, мг/л:

КН|РО 937, 5

М,НРО„ 2Н,О 787, 5

М ЬОр 7 Н 0 562,5

Н 5О 706,0

СаСРр (безводный) 112,5

Ре5О, Н,о 42,7 йа 50ц(безводный) 225,0

Cu50q 5Н О 20,5

A 7Н,О 2,5

Nci gMgOi, 2 Н О

Мпбо НО 1,7 соС02 бН О 0,5

Вода До1л

Скорость разбавления О, 18, скорость перемешинания 3000 об/мин-.

Культивирование осуществляют при подаче метано-воздушной смеСи, содержащей 18,2 об.% метана и 18,:6 об.% воздуха. рН 6,5 поддерживают при помощи NaOH и регулируют добавлением

Подача азота в виде аммиака, мг/л ч

Выделено азота в виде протеина, мг/л ч

Потери азота в ферментаторе в вице аммиака в отработанной среде, из расчета наличия 2 мг/л ионов аммония, мг/л.ч

Чистое поглощение микроорганизмами азота, подаваемого в ферментатор в виде аммиака, мг/л ч

1,0%-ного раствора МоОН. Азот s ниле

1,1 н. гидроокиси аммония подают в ферментатор при постепенно возрастающей скорости для поддержания концентрации клеток 13 г ""óõñãî вас- на 1 л.

Избыток концентрации ионов авиона- н питательной среде определяют нэне:.:— ным колориметрическим способом н, робах го 10 мл бульона через каждые

5 мин. Избыток ионов аммония в ср".де поддерживают на уровне 5-10 мг/л р=-..-. гулированием скорости подачи гидр эс киси аммония н ферментатор. После достижения концентрации клеток 13,7 г с,— хого веса на 1 л культивированн=. пго"

15 должают еще 24 ч. На этом этапе скорость подачи гидроокиси аммония н ",ерментатор поддерживается постоянной.

Скорость працуцирования бактерк;льных клеток составляет 13,7i0,18 г (cvхсй вес) на. 1 л в 1 ч. Выход no i;=-..ãàну, т.е. вес клеток, продуциронанн- х на единицу веса метана, подаваемог.-. н ферментатор, составляет 0,63. Выход по кислороду — 0,23.

25 л . Стадия получения готîâ го продукта. Подачу в ферментатор гидрсокнси аммония снижают в три стадии: на

30%, на 65%, на 100%. Во всех случаях ферментация восстанавливается чеЗ0 реэ несколько часов при более низкой концентрации клеток и необнаружннаемой низкой концентрации ионов аммония в среде.

В таблице приведены данные, полу35 ченные при установившейся непрерывкой работе на каждой стадии при избытке иона аьмония в среде (5-16 мг/л), а также данные контрольного опыта (получение бисмасс по известному спосо40 бу) °

578901

Продолжение табл.

Способ получения биомассы

Показатель, единица измерения предлагаемый по стадиям известный

Удельная скорость разбавления, ч

О, 174

10,840

О, 179

9,910

О, 180

13,760

0,176

11,760

Концентрация клеток, г/л

Продуцирование клеток, г/л.ч

2,470

1, 770

1, 890

2,070

Концентрация ионов аммония в бульоне, мг/л

12,000

Прибор с пределом чувствительности 2 мг/л не обнаруживает ионов аммония

Суммарное содержание азота в клетках,Ъ на сухое вещество

11,600

11,500

ll 600

11,600

Содержание готовой биомассы в клетках,В на сухое вещество (количество азота, помноженное на 6,25) 71,900 72,500

72,500

72,500

Формула изобретения

Составитель В.Матвеева

Техред . 3. Фанта Корректор И. Гоксич

Редактор Н.Хубларова

Эаказ 3838/709 Тираж 541 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ получения биомассы путем непрерывного культивирования метанутилизирующих микроорганизмов в жидкой питательной среде, содержащей ассимилируемые источники азота и минеральные соли, при подаче метано-воздушной смеси, отличающийся тем, что, с целью частичной заменй связанного азота в форме аммонийных или нитратных солей мрлекулярным азотом атмосФеры или полного исключения из среды связанного азота, в качестве 45 метанутнлнзирующих микроорганизмов используют микроорганизмы Hs рода

Ме0чфососыз, обладающие способностью фиксировать атмосферный азот при этом количество связанного agora в питательной среде регулируют таким образом, чтобы его уровень.в среде в процессе выращивания был меньше того количества, которое содержится в готовой биомассе.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что из рода Ме йфософ ц,у используют вид eapsueatus .

И ст очники информации, прин ятые в о внимание при экспертизе:

1. Патент Великобритании Р 1150401 кл. С б F 1969 °