Способ получения 7-( - -аминофенилацетамидо)- дезацетоксицефалоспорановой кислоты (цефалексина)

Способ получения 7-( - -аминофенилацетамидо)- дезацетоксицефалоспорановой кислоты (цефалексина)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

eoeco a т ен > м е- .охз,нм вфеиЮ

on HCAHHE

ИЗОБРЕТЕН Ия

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (») 579903. (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 19.08.72 (21) 1823277/28-13 (23) Приоритет — (32) 20.08.71 (31) 46-637 15 (33) Япония (43) Опубликовано 05.11.77.Бюллетень № 41 (45) Дата опубликования описания06.10.77 (51) M. Кл.о

С 120 9/00

Государственный комитет

C0BBT& Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 615.779.9 (088. 8) Иностранцы

Тадасира Фудзии, Кунио Мацумото, Юзэ Сибуйя, Казуми Ханамицу Цутому Ямагути, Тецуо Ватанабе

И Дзинносуке Aбе (Япония)

Иностранная фирма

//

Тойе Езо Кабусики Кайся (Япония) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-(L1- оС АМИНОФЕНИЛАЦЕТАМИДО)-ДЕЗА ЦЕТОКСИЦЕФА ЛОСПОРА НОВОЙ КИСЛОТЫ (ЦЕФАЛЕКСИНА) Изобретение относится к фармацевтической промышленности.

Известен спэсэб пэпучения цефапексина, заключающийся в тэм, чтэ 7-аминэдезацетэксицефап оспорен эвую кисл эту (7-АДЦК) подвергают аципирэванию сэединением группы Д-фенипгпицина с блокированной аминогруппэй с пэспедуюшим удапением блокирующих групп, Одна к э так эй сп эс эб труд эемки й.

С цепью упрощения способа аципирование осушествпяют в присутствии ферментного препарата из микроорганизма Асят ОтттоЬастЕ

В-402-2 M RR ЬВ-5 39 3.

Штамм В-402-2 выращивают на косом агаре при 30 С в течение 24 ч. о

Внешний вид. Короткие палочки с кругпыми концами, размером 0,5-0,8х2,0 мк, эциночные кпетки иногда образующие цепочки, оболочка отсутствует, неподвижны, спор нет.

Окрашивание пэ граму отрицатепьное.

Киспотэупэрность отрицатепьная. Растет на различных средах. 25

Чашки с агарэм, засеянные бульоном о (при 30 С, 24 ч ). Рост хороший, выпуклые на возвышении, колонии не размазаны, белого ипи светло-жептого цвета, блестящие, мягкие, увлажненные, полупрозрачные, цвет среды не изменяется.

На косом агаре, засеянном бульоном о (при 30 С, 24 ч ), Рост копоний хор оший, гладкая поверхность, не размазываются, блестящие, увлажненные, колонии молочно-белого цвета, полупрозрачные, цвет среды не изменяется.

На бульоне (при 30 С, 2 дня). Рост хороший, неоднократно мутный, не образует осадка, не происходит образования пленки, нет пигментации.

Укэпочная культура бульона, засеянного

HB желатине. Поверхность роста вдоль линии укола на половине высоты погружения, не происходит снижения желатина.

Соевый косой агар (30 С, 24 ч.). Рост хороший, белые ипи светло-желтые колонии, гладкая и мягкая п эверхн ость, п опупр озр ачные, цвет среды не изменяется.

579901

Картэфепьный агар (30 С, 5 дней). Рост хороший кэпонии молочно-бепэго цвета с

) гпадкэй и мягкой поверхностью, выпукпые

HB возвышении, цвет среды ке изменяется.

Лакмусовое мопоко пептонизирует.

Нитраты не восстанавливает. Реакциия денитрирования отрицательная. Индэп образует спабо, образование гидросупьфата rloложительно. Гидролизует крахмал. Сильно усваиваег цитрат. Усваивает нитраты и 1() сопи аммония. Пигмента не Образye T. рН роста 5-9, эптимапьный рН роста

7-8. Оптимапьная температура роста 24-30С.

Условия аэрэбкые.

Штамм Ас>п ГотоЬЗО1е(В-402-2 депэни- 15 рован B икст!!Гутс микрэбиэпэгическэй пр мыш,!BHHDc Tи, агенства науки и техники, Т F. 1((> М -Р 1>& 1095 °

Штамм бып также депонирован a DTr(B(le сепьскэгэ хозяйства HBy>l(ID-исспедэватепьс- 2(! кэй с(!ужбы сепьс(тэгэ хозяйства пэп HDMBромМ (В В-5393. Зти (птал!мь(микроэрганиз! IDB ипи их ферментные препараты эбпадают специфической актлвкэстью к цефапексику, а также способствуют кэпичествек- 25

A I(> I>+ ному получению цефапексина (з 7-А({, и

Д-фенипгпиципа.

1ципиру!Ощие ферменты, вырабатываемые микроорганизмами, пэпучают аэрэоным 1 к1>пьгн(виэ Овэ({иэм В пктатепьнэи среде>

>> >> сэдержащеи органический !{пи неэоганический нстэчl{ик азэГа, пап(э(! !Вр пептэн, л>>снэ:1 экстэакт, кукурузный зкс((эакт, дрожжевой экстракт. сухие дрожжи, соевый оепковыи

ГИДР ОПИЗат. ННТРВ1 Ы, CD!I!1 ан>!МЭ(!ИЯ> ИСТОЧ- >) ники угnBp Drlà„наприл:.Bp> мепассу,. гпюк эзу, гидр эпизат Kp BKM >п{а и ке эргаки=(BCKHB сопи а так ке другие и;1дхэд.".щие важны;-.

> > >

ВЕЩГ CTBQ ДПЯ СТИЛ!1>ПЯI,"!>И P С Га ПРИ

35 C в течение 12-48 ч. .((!

11ри (!0OMI {(TIH(IBHHDI,(пэч) чекки применяют и ol"p >ê!(эе ку пьгив(!р DBBHHB в >IBp эбных ;сп(, виях.

Д>(я фер»>1екта > ив ->ых ре-BKIIHÉ иск эчь зу!Эг ферменткые препараты, микрэбкые купьгуры, а также (IBTHB(lûB бактериапьные кпетКИ> Собран:ib:(-=, ПЭ(.:TIB !!уг!Ь,THBHpo>BBHИя, ИПИ их суспекзии.

Мэжн о примени Гь мнкр 06!{ы е кпе тки> обработанные химическим ипи физическим путем, например K!IBTK!I> высушепнь(е BHBI DH0M, мета нэпом, ипи этакопом, кпе тки> высушенные посредcTBDM гиэфипьнэй сушки кпетки измепьчеккые ипи эбоабэтак!{ые

l. упьтразвуком, пиза-.ы KTIB TDK, и Эпучаемые

> обработкой буферными растворами ипи хпо> ристым цет({ппиридипиел1, очищенные нерменты, попученкые известными способами раздепен !я и Очистки, например высапиванием, эсадитепьным фракциокирэвакием, диа6О пизом, абсорбционной хроматографией, ионообменной хроматографией ипи фильтрованием через гель измельченных кпеток ипи кпеточных пизатов, и твердые ферментные препараты ипи ферменты в нерастворимом состоянии, полученные абсорбцией аципирующего фермента ипи микроорганизмов, которые его вырабатывают, на инертном носите пе, неактивном, и пи субстрата и не активирующем указанную активность аципирующего фермента, причем допжна поддерживаться аципирующая активность ферменГа.

Процесс аципирования можег обычно предшествовать реакции 7-АДЦК и фенипгпициHB ипл егэ прэизвэднэгэ B присутствии аципирующих pep MBH THBIK препаратов, Пэименяют свободную 7-AfJUK концентрацией 0,1—

20 мг/м>1, предпочтительно 2-5 мг/>мп„, I,-фени!Ггпицин не явпяется субстратом в виде свободной киспэты, и пээГэму MDKHD применять его активные П1зэизводные, например амид ипи эфир низшего спирта, предпэчтитепьНо метиповый эфир, Производные фенипгпицлна применяют B кэпичестве„сэставпяющем

2-20-кратный мэпярный избыток пэ отношению к 7-!1)ЩК;,эдкакo этэ мопярнэе сээткэ (ение можно изменять в завлсимости DT концентрации 7-AQLlK B ре"-.KHHDHHDé смеси, причел! бопее предпэчтитепьно применять

6-1 О>- кратный мэпярный избытDK. TB!> (IB>pBтура реакции K!D)KBT быгь приспособпена и уCH! DBHHM Обыч 0 пяег 20- -;5 С, предпэчтитепькэ 30-3! С. л 1эжнэ испэпьз )BBTB неподвижную культуру, а таКжЕ Веб«.г(тЫВаЕМуЮ ИПИ ПЕ>рЕЛ(Е>Ш>(ВаЕМуЮ купь гуру, Значение p H рва :.ци OH!(ýé(cKIBc({

i! DuT1Bp);.Нвается в интервапах 5,5-7>5, эпти;лапькэ 6,0-6,5, Времч реакции может варьировать в зависимости эг успэвнй реакции, эбычкэ DHO 0,5-3 ч, и peBKIIHID»i>MDmHD

ЗBB(P I; > TB ПО(,»1;>С! H){{Bi{HI! «> ЭПУ»еi>! и ((BI>

6Dпьшег0 к эпика Гва цщ(а!!ексина.

При !;pэведекии аципирэвакия на твердых ((>ерл{е(лтных ире >BpBTctx сначапа аципирующий фер мент ипк микроорганизм, KDTDpBIB его

Вырабатывают, абсорбируют ка носителе.

В спу {де экдэфермепта ка нэситепе абсорбирую- нативные микробкые кпетки, сэбранные изкупьтуры микроорганизмов, вырабатываюпгих ферменты, ипи из кпетэк микроорганизмов, высушенных BIIBTDHDM HIIH этанэпэм.

Можно Гакже абсорбировать на кэситепе расТВ0р аципирующегэ фермента, экстрагир э в: — >нн эг 0 из микробных кпе ГDK.

Носитепи, применяемые B,(lðBäTIBãBBMDM способе, подбирают, учитывая их свойства, а именно:абсорбировать фермент и л!икрэбные кпетки, не инактивирэвать активность

579901 проводят при оптимальном значении рН и роб. при температуре активности фермента, Реакцию осуществляют пропусканием через кoIIонну твердого ферментного препарата, а непрерывную операцию осуществляют непрерывным добавлением субстрата. Если субстраты обнаруживаются в вытекающем потоке, то скорость этого потока уменьшают ипи рециркупируют пропусканием его снова через колонну. При уменьшении ипи потере активности фермента операцию прекращают.

Полученный таким образом цефапексин выделяют известными способами. Например, реакционную смесь пропускают через анионообменную смолу ипи активированный уголь, эпюируют водным раствором кислоты ипи смесью органического растворителя и воды, после чего концентрируют вытекающий потoK содержащий цефапексин, дпя осаждения изоэпектрическим способом. Можно также подкиспять реакционную смесь до рН 1 добавлением трифторуксусной кислоты, после чего полученную смесь экстрагируют органическим растворителем, например метипизо— бутипкетоном, что приводит к изоэпектрическому осаждению после растворения в подкисленной воде. Реакционную смесь можно обрабатывать анионообменной смолой в присутствии органического растворителя, не смешивающегося с водой, и концентрировать посредством пиофипьной сушки водный слой и с целью выделения цефапексина в виде свободной кислоты.

Определяют цефапексин следующим обра35

Испытуемый раствор, содержащий цефапексин, подвергают микробиологическому анализу по бумажно-дисковому ипи чашечному методу с пэименением штамма микроорга40 низма Вас 11из виЬЕ Йз PCI-219 в теч ние 16 ч при 37 С. Измеряют полученную зону ингибирования и подсчитывают силу действия цефалексина с использованием стандартнои кривой для цефалексина.

45 Пример 1. 100 мп водной среды (рН 7,0), содержащей,%: глюкоза 3, дрожжевой экстракт 1, К НРО 0,1,МЯ60 7H 0

0,05, КС1 0,5 иУе90, 0,001, стерилизуют при 120 С 20 мин. аципирующего фермента (они не допжны удалять абсорбированный фермент ипи мик ные клетки посредством пРомывания). Носи тель должен быть инертным дпя каждого субстрата и не должен абсорбирэвать полученный цефапексин. При абсорбировании водных растворов ферментов в качестве н ситепей применяются активированная окис алюминия, диатомовая земля, глина кисло характера, активир ованная глина, ка олин, фосфат кальция, эксиацетат и т. п. Дпя абс эрбир ова ния ми кр обных к не т ок пр еимущес венно применяют КИ-целлюлозу, КИ-сефадекс, ДЭАЭ-целлюлозу, ТЭАЭ-целлюлозу, диатомовую землю и т. п.

Контролируют наличие стойкого рН аци пирующего фермента ипи абсорбирования фермента на носителе. Абсорбцию можно осуществлять периодически ипи B KonoHKBx

Абсорбцию в колонках рекомендуют дпя не прерывногэ ферментативного процесса. Количество носителя можно варьировать в зависимости or количества микробных кле ток, ферментативнэй способности фермент или а бс орбци энной снос эбн ости носителя.

При абсорбции периодического типа копичествэ носителя может составлять 5-20кратный избыток (по объему) or нативных клеток. Дпя абсорбции в кэпонках поспеднюю,запопненную носителем, смачивают водой ипи буферным раствором, значение р

Kotoporo соответствует оптимальной велич не дпя фермента, пропускают через нее ку турапьный бульон ипи ферментный pQGTBop

Затем указанную колонку промывают водой или буферным раствором. В резупьтат эбразуется твердый ферментный препарат кэпэночного типа.

При абСорбирэвании.микробных клеток на носителе к ау@пензии микробных клеток в воде присоединяется носитель, что может оказывать влияние на рН, так как абсэрбция в сильной степени зависит от ионной сипы.

Носитель, абсорбирующий ацилирующий фермент ипи микробные клетки, а именно твердый ферментный препарат, может обпа дать нежелательной способностью ухудшат ипи терять свою активность, если он становится спишкэм сухим, поэтому его следует поддерживать во влажном состоянии.

Далее 7-АДЦК вступает в реакцию с фенипглицином ипи его производным в присутствии твердэго ферментного препарата. Конце н тр ация 7-АДИК с ос тавпяе т

0,1-2% (по весу и объему), предпочтительно, 0,2-1% (пэ весу и объему), а концентрация фенипгпицина ипи его производнэго должна в 2-10 раз превышать мопярное количество 7-АДЦК. Реакцию аципирэвания

Среду заражают штаммом AслvowoЬас1еr

В 402-2ЮЗЬ В 5393 и при возвратно-по тупательном взбалтывании культивируют при

26оС 72 ч. Доводят рН культивируемой среды до 6,5 и к ней добавляют 100 мл 0,1

М фосфатного буфера (pH 6,5), содержащего 2 мг/мл 7-AQUK и 20 мг/мл хлоргидрата метилового эфира Д-фенилглицина, после чего проводят ферментацию при

37 C в течение 3 ч. Выход цефапексина в реакционном фипьтрате 100%. Указанный

579901

Составитепь С. Малютина

Редактор Л. Вопкова Техред A. Демьянова Корректор M. немчик

Заказ 3595/48 Тираж 541 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фипиап ППП "Патент", г. Ужгород, уп. Проектная, 4

9

160 мг высушенных клеток Acg o оЬасД В-402-2КЗЖЮ-5393 (РЕЯМ-Р% 1095) суспендируют в 4 мп 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН 6.0) и полученную суспен-, зию добавпяют к 10 г ДЭАЭ-цеппюпозы в 20 мп 0,1 М ацетатного раствора (рН 6,0) при перемешивании. Поспе выдерживания в течение 6 ч указанный носитепь, абсорбировавший микробные кпетки, т.е. твердый ферментный препарат, помещают 19 в колонну, промывают 0,1 М раствором ацетатного буфера (рН 6,0) и через копонну пропускают 100 мп О, 1 М раствора аце татного буфера (рН 6,0), содержащего

0,1% 7-АДЦК и 0,5% хпоргидрата мети- 15 пового эфира Д-фенипглицина, в течение

5 ч. Степень аципирования, определенная в расчете на копичество цефапексина в эпюате, 85О/.

Пример 6. К суспензии 4 г высушен-2О ных клеток АсЬ отоЬас1е " В-402-2 РЕРМР

No 1095, полученн ых по примеру 5, в

500 мп 0,1 N раствора ацетатного буфера (рН 6,0) добавпяют 50 мг лизоцима, выдерживают при 37 С в течение 60 ч 25 и к попученной суспензии добавняют 2 мг дезоксирибонукпеазы и попученную смесь выдерживают при постоянной .температуре в течение 10 мин.

Реакционную смесь центрифугируют и к 30

200 MTI верхнего споя жидкости добавляют

10 г оксиапатита, а затем выдерживают в течение 1 ч.

Твердый ферментный препарат помещают ф в колонну и проводят ферментативную реакцию,описанную в примере 5. Выход полученного цефапексина 90/о.

Пример 7. 600псреды (рН7,0), содержащей,%.,: гпюкоза 4, дрожжевой экстракт 1,2, К НРО» 0,15,МЯ504 Н 0 0,05, О

КС1 0,05 иУе50 0,001>заражают 30 и

10 посева культуры штамма Achr oãèoÜàc1å

В-402-2 КЯЧ L В-5393 и культивируют в погружных усповиях при аэрации в течение 72 ч при 26 С.

После ферментации бактериапьные клетки

"обирают из 570 л бупьона посредством центрифугирования. Нативные влажные клетки, количество которых соответствует 970 г высушенных клеток, суспендируют в 27 и

О, 1 М раствора ацетатного буфера (рН 6,5), к попученной суспензии добавпяют 1,18 кг

7-АДЕ(К (чистотой 84,8%) и 30 кг хлоргидрата метипового эфира Д-фенипгпицина, а затем добавпяют 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН 6,5) до 200 д объема реакционной смеси. Выдерживают смесь при

3 оС в течение 3 ч при перемешивании.

В реакционной смеси опредепяют содержание 1,28 кг цефапексина по даннымупьтрафиопетовой спектроскопии (степень аципирования 80%). Раствор центрифугируют и снова фипьтруют. К прозрачному раствору добавпяют 4 кг активированного угпя и поспе финьтрования водный спой конденсируют под вакуумом. Получают 1,03 кг цефалексина (выход 64%, чистота 98%).

Формупа изобретения

Способ получения 7- (Д -оа -аминофенипацетамидо)-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (цефапексина) пут ем аципирования 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты соединением группы Д-фенипглицинг, отличающийся тем, что, с цепью упрощения способа, ацилирование осуществляют в присутствии ферментного препарата из микроорганизма Ас ротоЬасМ

В-402-2 и КК(В-539 3.