Способ получения ферментного препарата, обладающего гемостатическим и антикоагулирующим действием

Способ получения ферментного препарата, обладающего гемостатическим и антикоагулирующим действием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

) ъ. .А й

ОП ИСАНИЕ

Союз Советских

Социалистических

Реотублик (()1 г,о ) ц ).

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К fIAl ÅH1Ó (6l) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 180172 (21) 1738944/13 (23) Приоритет — (32) 18.0!.7! (31) 7 3 3/7 1 (33) Швейцария (5l) М. Кл.

С 07 (3 7/026

А 61 К 3)/58

Государственный комитет

Совета Мнннстрав СССР оа девам нзооретеннй н открытей (43) Опубликовано 251177. Бюллетень № 43 (53) УУ1К 615. 779. 94 (088. 8) (45) Дата опубликования описания 171177

Иностранцы .р Эдмунд Э.Перс, Курт Ф.Штоккер (Швейцария), Биргер Бломбэк, Маргарета Бломбэк и Биргит Хессел (Швеция) изобретения

Иностранная фирма Пентафарм АГ (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГЕМОСТАТИЧЕСКИМ

И АНТИКОАГУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к Фармакологической промышленности, а именно к производству лекарственных препаратов.

Известен способ получения лекарственных препаратов из яда змей ВбЮтърв

1аraraca иьи ЬасМые, at, ro x, эаключаюшийся, в том что, яд растворяют в дистиллированной воде и .выделяют две активные фракции путем последовательного осаждения сульфатом аммо- 10 ния и сульфатом. магния. Обе фракции раздельно диалцзуют., фракцию, . содер" жащую токсины, :облучают светом квар" цевой лампы„обе фракции раздельно растворяют в воде и растворы смеши- 1б вают, добавляют к раствору хлористый" натрий и фенол и после отстаивания фильтруют.

Полученный ферментный препарат обладает способностью свертывать кровь,20

Предложенный способ получения ферментного препарата, обладающего гемостатическим и антикоагулирующим действием, заключается в том, что изотонический водный раствор яда змеи

SoНи oрв atrох или яда с аналогичной иммунной реакцией с рН

4,5-7,0 подвергают фракционированию, например, сульфатом аммония, тепловой обработке при 30-50 C и рН 3,02

4,0, частично очищенный раствор обрабатывают фенолом или производными фенола и выделяют целевой продукт из комплекса с последующей очисткой иэ— вестными приемами.

Способ осуществляют следующим образом.

Высушенный посредством лиофильной сушки змеиный яд, например яд

Bathroys atra x,, растворяют в физиологическбм растворе хлористого натрия при рН примерно 4,5-7,0. Нераст. воренный материал удаляют из раствора центрифугированием или фильтрованием.

Прозрачный раствор яда доводят до слабокислого значения рН (примерно до 3/4) добавлением минеральной кислоты, например соляной, серной или уксусной, а затем нагревают при перемешивании так, чтобы произошло осаждение балластных белков без какой-либо потери активного вещества.

Степень такого осаждения зависит от времени нагревания и температуры, а также от рН раствора. При рН 3 достаточно нескольких минут, например 10 мнн при 30 С. При рН 3,5 время нагревания удлиняют до час при

30оС или до 30 мин при 40 С.

581872

Осажденные белки отделяют центрифугированием. Доводят рН фильтра до

4,5-7,0 и подвергают фракционному осаждению соли с целью удаления сначала фракции балластных веществ., а 5 затем для осаждения фракции активных веществ. Такое фракционное осаждение проводят аммониевыми солями или солями щелочных или щелочноэемельных металлов минеральных кислот, например хлоридом или сульфатом аммония. Если применять сульфат аммония, рН 6,5, то фракция балластных веществ осаждается при концентрации 40Ъ, а активная фракция при концентрации 55% (при

20 C). При использовании других солей, значений рН и температур осаждения необходимы различные концентрации насыщения. Активную фракцию выделяют из маточной жидкости центрифугированием и ра -.творяют в дистиллированной воде.

Значение рН раствора доводят до 4-6.

Активное вещество осаждае-ся в виде комплекса добавлением примерно 7 вес.% фенола или производного фенола; можно также применять фенолформальдегидные смолы содержащие свободные фенольные группы.

Отделенный комплекс промывают несколько раз О, 1-0,5Ъ-ным раствором уксусной кислоты в полярном растворителе с целью разложения комплекса и растворения фенола или производного фенола. Комплекс, состоящий из активного вещества и Фенола или производ- 35 ного фенола, растворяют в воде при рН 7,5-8,5. Значение рН доводят до укаэанной величины добавлением гидроокиси щелочного металла. Раствор фильтруют под давлением азота через 4О ультрафильтр с такими размерами отверстий, чтобы активное вещество (ферментный состав) оставалось на фильтре, а фенол или производные фенола проходили через фильтр в раство-,ц ренном состоянии.

Активное вещество, которое остается на фильтре, промывают несколькими порциями дистиллированной воды или раствора подходящего консерванта с 6О целью удаления остатков фенола или производного фенола. Ферментный препарат, который оказывает в малых дозах гемостатическое действие, а в больших дозах — антикоагулянтное дей- ствие на кровь человека и других млекопитающих, имеет следующие свойства.

Обладает тромбиноподобными свойствами эндопептидаэы. Он содержит пептидный компонент и углеводный компонент, причем пептидный компонент включает один или несколько полипептидов с молекулярным весом примерно от

18000 до 55000, определяемым по способу балансирования с применением ультрацентрифуги . 65

Препарат содержит углевод (саха) нейтрального характера) в количеств

2-10 вес.Ъ от белкового содержимого> слабо растворим в физиологическом растворе хлористого натрия, образует комплексы с фенолом и производными фенола, слабо растворимые или не растворимые в воде. Вызывает коагуляцию фибриногена путем избирательного удаления фибринопептидов А из фибриногена без освобождения фибринопептидов В. Ферментный препарат обладает тромбиноподобной активностью, соответствующей 30-450 ед. тромбина (К lR) на 1 мг белкового содержимого.

Расщепляет метиловый эфир п-толуолсульфониларгинина и желатину, но не расщепляет метиловый эфир лизина, этиловый эфир фенилаланина и -ацетилметионин, N -ацетилтиозин, лейцилглицин и казеин. Препарат не ингибируется гепарином, гепариноидами, гирудином, антитромбинами и ингибитром многовалентной пептидаэы Кунитца. Он ингибируется при концентрации фермен та примерно 5 мг на 1 мл до содержания примерно 95% по отношению к его коагуляции и при активности эстеразы в отношении 2,5х10 змолей диизопропилфторфосфата при рН 8 в течение

2 час. Он полностью ингибируется метиловым эфиром п-толуолсульфониларгинина и полностью ингибируется антителами, содержащимися в сыворотке, не восприимчивой, к змеиному яду, он не фиксируется и поэтому не инактивируется фибрином.

Препарат обладает в значительной степени более длительным временем полураэложения, чем гепарин. Он вызывает образование производного фибрина, который взаимодействует с избытком фибриногена с образованием неполимериэуемого комплекса фибрина с фибриногеном. Он воздействует на фибриноген с образованием фибрина, который обладает физико-химическими свойствами, отличающимися от свойства фибрина, полученного из тромбина, так как он быстро гидролизуется фибринолитическими ферментами, например плаэмином, даже в присутствии активированного фактора Х11 и ионов кальция и раство рим в 5 М водном растворе мочевины и вызывает а (о дефибриногенирование и фибринолиз без побочного геморрагического и тромбоэмболического действия.

Ферментные составы можно применять в качестве реагента и вспомогательного средства для физиологического изучения свертывания крови .(fl 9(t o например, для исследования превращени фибриногена в фибрин в присутствии гепарина и антитромбинов для исследований с фибринопептидами для изу581Р )2 пения наголо< ических фибрннных >:< Г>у><тур, пр< дуктов разложения фибриногена, фактора Vill и фактора Х!!!

При назначении в умеренных дозах ч<чп ферментный состав вызывает уменьшение кров<>течен> я и времени

Гвертывания крови у экспериментальных

«ивотных, а также у бопьных с нормальным или патологическим состоянием свертывания крови . Г!ри внутреннем вве- (0 дении здоровым людям в умеренных доаа>< ферментный препарат вызывает образование растворимых комплексов фибрина с фибриногеном в токе крови, о чем свидетельствуют поло><ительные пробы на криофибрин и паракоагуляцию в плазме, а также )! -терминальный анализ фракций плазмы пациентов. Поэтому предложенный ферментный состав можно применять в качестве кровоостанавливающего средства.

ГГри назначении нового ферментного состава в повышенных дозах собакам наблюдается быстрое дефибриногенирование, а также связанный с этим фибринопиэ и появление продуктов разложения фибриногена (ПРФ) в крови.

Дефибриногенирование и фибринолиз имеют место без каких-либо симптомов шока, без тромбоцитопении и без тромбических и геморрагических нарушений.

Клинические испытания больных с тромбозом вен голени или вен сетчатки показали, что ферментный состав особенно применим для лечения, сопрово>кдающегося дефибриногенирующим и фибринолитическим действием.

В очищенном состоянии ферментный состав легко раствори>; в разбавленных растворак солей, но слабо растворим в дистиллированной воде. Его можно 40 осаждать из водных растворов солями или органическими растворителями, смешивающимися с водой, можно обратимо фиксировать на иокообменных смолах основного характера и можно получить 45 водонерастворимые комплексы с фенолом и его производными.

Он характеризуется высокой термостойкостью и заметной устойчивостью к кислотам. В качестве кровоостанав- 50 ливающего средства ферментный препарат данного изобретения можно назначать в суточных дозах, примерно 0,25/

/),4 ед. N 1H на 60 кг веса тела.

В качестве антикоагупянта для крови ферментный состав можно применять в суточных дозах примерно 7 — 14 ед. и 1 Н на 60 кг веса тела.

Пример 1. 20 г змеиного яда вида Ь<>th< оps at> ок ðaстворяют в 1000 мл О, 9%-ного раствора хлористого натрия, а затем центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 3000oG/мин.

Осадок удаляют. Доводят значение рН центрифугата до 3,5 разбавленной уксусной кислотой, нагревают при 30 С н те.ение 1 час на водяной бане, а затем снова центрифугируют. Остаток удаляют, доводят значение рН центрифугата до 6,5 едким натром и объем раствора доводят до 1000 мл 0,9%-ным раствором хлористого натрия. К этому

pa<" вору добавляют при перемешивании

670 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 час, а затем полученный осадок отделяют центрифугированием. К центрифугату добавляю еще 552 мп насыщенного раствора сульфата аммония и через

1 час смесь снова центрифугируют. Центрифугат отбрасывают, осадок растворяют в 100 мл дистиллированной воды, доводят рН раствора до 5,0 разбавленной уксусной кислотой, к раствору добавляют 7,7 мл 90%-ного фенола при перемешивании. Смесь выдерживают в течение 15 час при комнатной температуре. Затем осажденный фермент отделяют центрифугированием. Центрифуzат отбрасывают. Осадок промывают дважды по 10 мп воды, насыщенной фенолом, отделяют центрифугированием и обрабатывают 50 мл этанола, содержащего 1Ъ уксусной кислоты. Смесь перемешивают в течение 1 час, а затем фильтруют через стеклянный ва:уум— фильтр. Выделенное вещество промывают несколькими порциями по 20 мп этанола и высушивают под вакуумом.

Получают 2-2,5 г ферментного состава (степень чистоты 1), обладающего тромбиноподобным действием (примерно

10 — 12 д. на 1 мг сухого вещества).

Полученный продукт обладает стойкостью при хранении.

Неочищенный фермент обрабатывают

40 мп три с-фосфатного буфера (рН б, О) и перемешивают в течение 15 мин. Нерастворившуюся часть удаляют иэ раствора центрифугированием. Прозрачный центрифугат заливают со скоростью

0,8-1,0 мл/мин в колонну, наполненную 200 мл ДЭАЭ-сефадексом, нейтрализованного трис-фосфатным буфером, а затем элюируют 800 мл того же буферного раствора. Первый элюат отбрасывают. Фермент элюируют 4400 мл трис-фосфатным буфером (0,04 моля).

Активный элюат извлекают и концентрируют «а ультрафильтре УИ-10 (Амикон ) под давлением и прбчывают до полного отсутствия солей.

Концентрат, не содержащий солей, высушивают под вакуумом над фосфорным ангидридом или подвергают лиофильиой сушке. Получают 200-250 мг ферментного состава со степенью чистоты ff обладающего активностью 100-150 ед. !

ГRH тромбина на 1 мг белкового содержимого.

581872

Формула изобретения

Составитель С.Малютина

Редакко А. Бе Текоед М.леакцкая Ко екто П. МакаРейич

Заказ 3941/3 Тираж 553 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москка Ж-33 Ракискак иаб. 43к 4Д

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Концентрат, не содержащий солей, затем концентрируют до 5 мл на ультрафильтре. Раствор фильтруют через стеклянный вакуум-фильтр пористостью

Я-4 с целью удаления каких-либо пылевидных частиц. Прозрачный раствор выдерживают в течение не менее 24 час в холодильнике при 2 С. Ферментный состав выделяют в виде прямоугольных кристаллов. Полученные кристаллы выделяют центрифугированием при 0-2 С, промывают несколько раэ по 0,5 мл дистиллированной водой при охлаждении льдом, а затем высушивают над фосфорным ангидридом. Получают 45 мл бес— цветного фермента, активность которого составляет 150-200 ед. тромбина (И 3. Я ) на 1 мг белкового содержимого

Пример 2. Колонну загружают

Сефадексом G-100. Гель Сефадекса нейтрализуют 10%-ным водным раствором уксусной кислоты. 6,26 мг ферментного состава, полученного по примеру 1 (степень чистоты Я ) растворяют в

0,3 мл 10%-ного водного раствора уксусной кислоты. Раствор заливают через колонну. Водный 10%-ный раствор уксусной ксилоты пропускают через ко лонку снизу со скоростью 5,6 мл в

1 час.

Образуются зоны поглощения ультра фиолетовых лучей (280 мл). Элюат, полученный из первой эоны, подвергают лиофильной сушке и получают 4,25 мг ферментного состава с активностью

200-250 ед. (Mt+I ) тромбина на 1 мг белкового содержимого.

Способ получения ферментного препарата, обладающего Згемостатическим и антикоагулирующим действиемР о тл и ч а ю шийся тем, что изотонический водный раствор яда змеи

Satheeps @tree или яда с аналогичной иммунной реакцией с рН 4,57,0 подвергают фракционированию, например, сульфатом аммония, тепловой обработке при 30-50 С и PH 3,0-4,0, частично очищенный раствор обрабатывают фенолом или производными фенола и выделяют целевой продукт из комплекса с последующей очисткой известными приемами.