Способ получения антибиотика, проявляющего активность в отношении -лактамазы

Способ получения антибиотика, проявляющего активность в отношении -лактамазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(т (с те ..;(к ческая

1, ; -": в у Q, с (а ("„.-) л( о с ((() 581881

ОП ИСА

Союз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К О тивгю (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл 2 (22) Заявлено 120376 (21) 2 333503/28- . 3

С 12 6 9/00 (23) Приоритет - (32) 15. 03. 75 (31) 10914/75 (33) Вели кобРи ания (43) Опубликоваио25.11.77, Бюллетень №43 (45) Дата опубликования описания ) 711:77

Государственный комитет

Совета й(инистров СССР оо делам иэобретений и открытий (53) УДК 615.779.931 (088. 8) Иностранцы

Стефен Джон Бокс н Джон Дик Худ (Великобритания) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Бичам Груп Лимитед (Великобритания) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА, ПРОЯВЛЯЮЩЕГО АКТИВНОСТЬ В ОТНО(ПЕНИИ Р -ЛАКТЫаЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, Предложенный антибиотик новый и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение антибиотика, проявляющего активность в отношении Р -лактамазы.

Эта цель достигается тем, что штамм Streptomq ces обивcev е

ATCC 31126 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта в виде свободной кислоты либо в виде ее солей.

Организмом для выращивания антибиотика является Мавр Са тпЧ сев oti,—

vneeus ARTCC 3l 1. 26 или его мутанты. Щ

Антибиотик получают из фильтрата культуральной жидкости, поэтому первоначальной стадией в процессе выделения является удаление тьердого материала из ферментационнаго раствора, 25 например, фильтрованием.

Выделение производят при температуре ниже 20 С (предпочтительно при температуре не выше 12 C) .

Антибиотик или его соль получают из ферментационного фильтрата путем адсорбции над аКтиВирОваииым углеМ, затем промывают его водным ацетоном и выпаривают растворитель при пониженном давлении. Неочищенный продукт снова очищают, растворяя его в воде, и экстрагируют в органическую фазу, используя липофильную четвертичную соль аммония для получения соли, растВоримой в органическом растворителе, с последующим обратным экстрагированием s воду или в разбавленный иодид натрия.

Для хроматографической очистки используют натриевую соль, так как соли лучше растворимы в в(,дных и водноспйртовых растворах, чем в сильно липофипъных растворителях, поэтому лучше испольэовать водные или водноэтанольные растворы. Водный раствор хлористого натрия, счэдержащий буфер при рН 7, например фосфатный буфер, используют в сочетании с несущими материалами, которые содержат четвертичные аммониевые группы. Пригоднм и несущими материалами являются основ

we ионообменные целлюлозы и основные ионообменные поперечно-сшитые декстраны.

581881

Отделение антибиотика от неорга. нических солей, а также других загрязняющих веществ осуществляют посредством его адсорбирования на липофильную смолу, на которой не адсорбируются неорганические соли.

Антибиотик удаляют из колонки элюированием (водой или водным спиртом), полученный раствор концентрируют выпа риванием и сушкой с вымораживанием.

Отделение антибиотика от неорганических солей осуществляют также хроматографией на колонке, состоящей иэ гель-фильтрующего агента, например поперечно-сшитого декстранового геля, например, $ер1adex G -15 или полиактиламидного геля, например, Bioget Р2 ..

Последующую очи ст ку анти би от и к а можно осуществлять хроматографией на колонке на инертной твердой фазе (сйликагель или целлюлоза), используя водно спиртовые растворительные системы (нада изопропанол, вода-н-про" панол, вада-метанол-иэопропанол, нода-. бутанол, вода-этанол-бутанол и дру- «@ гие) . Предпочтительной является проп@нол-вода 4:1 в сочетании с целлюлоэным носителем.

Фракции, которые показывают ультрафиолетовый спектр, характерный для антибиотика, обладают ультрафиолетовым максимумом поглощения приблизительно при 297 нм. Эти фракции собирают. Сушка с нымораживанием полученного раствора дает чистую соль 15 антибиотика.

П р.и м е р 1., Получение чистой соли антибиотика.

Б1тер1отпусеь pfi vaceus ATCC 41)

31126 выращивают в течение 7 дней при температуре 28 С на пласте твердого агара в бутылке Рукса.

Агаровая среда имеет следующий состав, г/лs 45

Дрожжевой экстракт 1о,о

Моногидрат глюкозы 10«0

Агар 15 0

Водопрон одна я вода до 1 л.

Перед стерилизацией рН среды до- @ водят до 6,8. 50 мл стерильной деиониэованной воды, содержащей 0,02% тнина 80, добавляют в одну бутылку Рукса и споры суспендируют встряхиванием. Эту споровую суспензию затем до- щ бавляют в качестве прививочного материала к 75 мл стерилизованной среды для высевания н 100 л ферментаторе из нержавеющей стали.

Состав среды для нысенания следующий, г/л:

Мука соевых бобов 10,0

Моногидрат глюкозы . 20,0

Водопроводная вода до 1 л.

Для уменьшения вспенинания к ферментационной среде добавляют в масле

0,2

10,0 соевых бобов 50 мл 10%-ного раствора

Р(цгНп(е L - 81 перед стерилизацией. Среду стерилиэуют паром в ферментаторе в течение 20 мин при 120ОС.

Высеваемую культуру перемешивают при

140 об/мин мешалкой и подают стерильный воздух со скоростью 75 л/мин.

Сосуд для выращивания снабжен отражательными перегородками. Температуру поддерживают 28 С и после инкубирования при таких условиях н течение 45 час 7,5 л этой посевной культуры добавляют н качестве посевного материала к 150 л стерильной фермен тационной среды в 300 л ферментаторе из нержавеющей. стали.

Ферментационная среда имеет следующий состав, г/л:

Мука соевых бобов 10,0

Моногидрат глюкозы 20,0

Мел (осажденный карбонат кальция)

Сульфат натрия

Хлористый кобальт (Со Ct g ° 6НеО) 0,001

Водопроводйая вода

До1 л.

300 мл 10Ъ-ного раствора Р1игопГа ("81 в масле соевых бобов добанляют для предотвращения нспенинания.

Ферментацию заканчивают через 48 час затем проводят центрифугирование.

Очищенный бульон имеет активность

340 ед/мл.

Очищенный бульон при 10ОС и рН 6,8 экстрагируют дихлорметаном при температуре 10 С, содержащем хлорид цетилдиметилбензиламмония, посредстном прокачки двух жйдкостей с заранее определенными скоростями через линейный смеситель. Фазы разделяют на непрерынной центрифуге Шарплеза после дополнительного перемешинания в тече. ние 2 мин, Дихлорметаноную фазу экстрагируют водным йодистым натрием.

Обратное экстрагиронание осуществляют четырьмя загрузками, используя общее количество воды 7 л, в которой содержится 210 г йодистого натрия. Фазы отделяют при помощи гравитации. рН водной фазы доводят от 7,7 до 7,( с помощью соляной кислоты и отфильт" ровынают. Экстракт йодистого натрия содержит 21900 ед/мл.

Ионообменную колонку подготавливают посредством кабинки QAE Sepha— с(ех А -25 в фосфатном буфере при рН

7, содержащем хлористый натрий, в стеклянную колонку диаметром 10 см до высоты 40 см.

Экстракт йодистого натрия (7 л) при температуре 5 С пропускают через

QA6 Seph.adea со скоростью

50 мл/мин. Колонку злюируют Но.Л в

0,05 М фосфатном буфере при рН 7 и температуре 5 С со скоростью 25 мл/мин.

2 л элюата ныливают, а 90 фракций

581881

Антибиотик при этих условйях адсорбируется на смоле, а неорганические примеси не адсорбируются. Антибиотик злюируют при комнатной температуре дистиллированной водой (200 мл), заЮ тем 50%-ным водным метанолом. Элюат (1 л) выпаривают при температуре ниже о

30 С при пониженном давлении до 70 мл, доводят рН до значения 7 и высушивают вымораживанием до коричневого твердой го вещества (2,18 г) при активности

5000 ед/мг. Другая порция антибиотика немного чище и имеет активность

5700 ед/мл. Это твердое вещество хроматографируют на целлюлозной колонке .I уравновешиваемой н-пропанолом-водой

4:1. Колонку элюируют, первые 135 мл элюата выливают, а затем собирают

15-миллилитровые фракции. Эти фракции, имеющ е ультрафиолетовое поглощение, 35 характерное для антибиотика, выпаривают при пониженном давлении, чтобы удалить н-пропанол, а затем высушивают вымораживанием, чтобы получить желтое твердое вещество. Это вещество 40 согласно анализу, обладает активностью 1600 ед/мг.

Пример 2. Ферментацию и выделение проводят, как в примере 1 до стадии элюирования из Ar!!bed(ite 45

ЧАД-4 включая ее. Элюат из колонки концентрируют при пониженном давлении цо объема 20 мл. Этот раствор вливают в колонку с Бе,phadex А-25 в 0,18M

34а04. Колонку элюируют сначала прн Q) экспоненциальнам градиенте хлористого

Растворительная система

Подложка

0,7

Бутанол-изопропанол-вода (7:7гб) Целлюлоза

Целлюлоза

Целлюлоза

Силикагель

Силикагель

0,7 (4! 1) н-Пропанол-вода

0,8 (7: 3) Изопропанол-вода

0,4 н .Бутанол-.метанол-вода (4:1:2) н-Пропанол-0,1М фосфатный буфер, рН 7,0 (7:3) 0,6 (100 мл) собирают . Фракции сканируют на ультрафиолетовом спектрофотометре и те, в которых наблюдают максимум поглощения приблизительно при 285 нм и которые являются смесью антибиоти-. 5 ка и примеси, объединяют, а значение рН доводят до 7 (число фракций 25-35); объединенный объем 1230 мп при активности 8450 ед/мл.

Хлористый натрий (5 г/100 мп) до- 10 бавляют к объединенной фракции, которую затем пропускают при 5 С через колонку диаметром 6,3 см, набитую смо лой Amberfite Ч Ад-4 до высоты 30 см, при скорости потока 20 мп/мин. натрия от 0,18 до 0,28 М при полном объеме 2 л, затем элюируют при постоянном содержании хлористого натрия

0,28 И. Колонку элюируют при 4 С со скоростью 3 мл/мин и собирают 25 мл фракции. Фракции с ультрафиолетовым спектроМ поглощения, характерным для антибиотика, объединяют.

Смешанные фракции выпаривают при пониженном давлении приблизительно дО 10 мл и загружают в колонку

3,8х28 см из В(оцИ Р2, уравновешиваемой в 1%-ном бутаноле. Колонку элюируют 1%-ным бутанолом со скоростью 2 мп/мин и собирают 5 мл фракции. Фракции с ультрафиолетовым спектром поглощения, характерным для антибиотика, и имеющие отрицательн.ю реакцию на нитрат серебра при определении хлорида, смешивают. Смешанные фракции выпаривают в вакууме, чтобы удалить бутанол, и высушивают вымораживанием, получают амфотерное твер" дое вещество.

Твердое вещество растворяют в минимальном количестве н-пропанол-вода (4:1) и разгоняют на целлюлозной колонке, уравновешенной в той же самой растворительной смеси. Колонку элюируют смесью н-пропанол-вода (4:1) со скоростью 1 мл/мин, при этом собирают

5 мл фракции, Фракции проверяют на ультрафиолетовое поглощение и те из них, которые имеют спектр, характерный для антибчотика, смешивают, выпаривают при пониженном давлении, чтобы удалить пропанол, и высушивают вымораживанием, получая светло-коричневое аморфное твердое вещество.

Антибиотик является двухкислотным твердым веществом, которое в виде чистой двухнатриевой соли обладает характерным инфракрасным спектром, имеет характерный спектр ядерного магнитного резонанса, обладает характерным ультрафиолетовым спектром, который в acme имеет максимум поглощения около 297 нм.

В чистом состоянии антибиотик в виде двунатриевой соли имеет значения

R для тонкослойной хроматографии, приведенные в таблице.

581881

Формула изобретения

Составитель С.Малютина

Редактор A.Бе Тех е . М.Левицкая Ко екто A.Макаревич

Заказ 3945/3 Тираж 541 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий.ы

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Элементарный анализ, проведенный на образце двунатриевой соли антибиотика, дает следующие результаты:

С 31,9%; Н 4,2% И 5,4Ъ; Ь 13,2%

Яа 11,64 ..

Антибиотик имеет мол. в . между 300 и 500 °

В чистом виде антибиотик н виде двунатриевой соли обладает хорошим уровнем антибактериальной активности против определенных грамположительных и грамотрицательных организмов, например против штаммов Вс сМиз

subtitis, Йntегоbacter ctonoae, lac .ha—

riokia coti, Ktebeietta aего nes, Р-otaus, wttab(tia, Satmonatta 4gpkimuvivm, Servatia ercescens, eta.p1 ц to еЪсeus aureus.

В чистом виде антибиотик н виде двунатриевой соли способен к синергист ич е cK ому дей ст вию н а ант и 6 акт ериальную активность J3 -лактамных антибиотиков (ампициллин и амоксициллин) и против некоторых бактерий, включая определенные р -лактамаэнопродуцирующие штаммы Иаpkg (ососсо s u

Ktapsiatta aarogases.

Двухосновньвки солями антибиотика являются фармацентически допустимые соли таких катионов, как натрия, калия, кальция, магния, алюминия, обыч ного аммония или соли замешенного аммония.

Наиболее предпочтительно использовать фармацевтически допустимые соли щелочных металлов антибиотика, например двуиатриевую соль или двукалиевую соль.

Фармацевтические композиции, которые содержат антибиотик или его фар,мацевтически допустимую соль, применяют для борьбы с бактерйальной инфекцией или для профилактики у млекопитающих, включая человека. Эти композиции используют для лечения заболеваний дыхательных путей, мочепо лоных путей, мягких тканей, кожи. Ком. позиции могут иметь форму для орального, парентерального, внутриполостноо, инъекционного применения.

Эти композиции обычно содержат от

10 мг до 5 r антибиотика или его соли, чаще всего содержат от 50 мг до 1,25 г соли антибиотика, например от 150 мг до 1,0 r.

Композиции могут содержать антибиотик или его соль в ниде единственного терапевтического агента, или могут содержать антибиотик или его соль вместе с другими терапевтическими агента5 ми, HarIpHMep, с пенициллином или с цефалеспорином, такими, как ампициллин, амоксициллин, карбенициллин, бензилпенициллин, с гидролизуемыми id ч(чо сложными эфирами вышеукаэан- ° ных пенициллинов, с феноксиметилпенициллином, цефалоридином, цефалотином, фефалоглицином, цемандолом, цефазолином, с ацетонными или формальдегидными аддуктами любых иэ вышеуказанных пенициллинов или цефалоспоринов, которые содержат с -амино группу н ациламино боковой цепи с клоксациллином, диклоксациллином, флуклосациллином или с другими известными ф -лактамными антибиотиками.

З0 Предлагаемый способ обеспечивает получение нового антибиотика, проявляющего активность н отношении р -лактамазы.

Способ получения антибиотика, проявляющего активность в отношении ф -лактамазы, о т л и ч а ю щ и йс я .тем, что, шатмм Streptomgcas

otivaаceus ATCC 31126 выращинают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта в виде свободной

М кислоты либо н виде ее солей.