Способ получения перевиваемой культуры клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е (щ 582283

ИЗО6РЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 11.10.74 (21) 2066799/28-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.11.77. Бюллетень № 44 (45) Дата опубликования описания 29.12.77 (51) М. Кл.2 С 12К 9/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР

Ilo делам изобретений и открытий (53) УДК 578.085.23 (088.8) (72) Автор изобретения

3. П. Наумец (71) Заявитель

Украинский ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт экспериментальной ветеринарии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КУЛЬТУРЪ|

КЛ ЕТОК

Изобретение относится к области биологии и может быть использовано в ветеринарной и медицинской вирусологии для получения длительно живущих in vitro клеток млекопитающих. 5

Известен способ получения перевиваемых клеток путем длительного культивирования первичной культуры без пересевов. При получении культуры таким способом через каждые

5 — 6 дней удаляют 1/3 старой культуральной 10 среды и заменяют ее таким же объемом свежей (1).

Культуру выращивают длительное время (3 — 6 месяцев) без пересевов, в результате чего за фазой первичного роста наступает фа- 15 за дегенерации. Это определяет недостаток известного способа, заключающийся в том, что трансформированные клетки, обладающие неограниченной потенцией роста, можно получать с очень низкой вероятностью, гранича- 20 щей со случайностью.

Наиболее близок к изобретению способ получения перевиваемой культуры клеток, включающий культивирование первичной культуры на питательной среде с последую- 25 щими регулярными пересевами клеток на свежую среду через 7 — 14 дней (2).

Однако эффективность такого способа довольно низка. Перевиваемую клеточную линию удается получить из клеток мыши, кото- ЗО рые обладают нестабильным кариотипом и легко, по сравнению с клетками человека и других животных, изменяются, Целью изобретения является повышение вероятности появления трансформированных клеток, обладающих стабильным кариотипом.

Для этого по предлагаемому способу в процессе пересевов клеток, начиная со 2-ой и последующих генераций клеток стадии замедленного роста, к свежей питательной среде добавляют до 1/3 2/3 ее объема среду предыдущего культивирования клеток до появления трансформированного роста всей культуры.

Предложенный способ позволяет создать условия для повышения вероятности появления трансформированных клеток. Из пяти образцов почек эмбриона крупного рогатого скота и одного образца селезенки автором получено 6 штаммов перевиваемых клеточных линий.

Способ заключается в следующем.

Корковый слой почти эмбриона теленка возраста 3-х — 6-ти месяцев измельчают, трипсинизируют по известной методике и суспендируют в среде, содержащей 05%-ный раствор гидролизатлактальбумина в сбалансированном растворе Хенкса, 10% сыворотки молодняка крупного рогатого скота, пенициллин и стрептомицин 100 ед/мл.

582283

Формула изобретения

Составитель Л. Мурая

Техред Н. Рыбкина

Редактор Н. Хубларова

Корректор Л. Орлова

Заказ 2702/5 Изд. № 981 Тираж 563

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, K-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

Концентрацию клеток устанавливают равной 100000 кл./мл и высевают в матрасы Ру.

В этой стадии клетки обладают активным метаболизмом, о чем свидетельствует быстрое подкисление среды (изменение рН от 7,2 до

6,8). Клетки веретенообразные, фибробластоподобного типа, плотно прилегают одна к другой и образуют монослой на 3-и — 4-ые сутки.

Для пересева клетки со стекла снимают

0,02 /о-ным раствором версена, иногда с добавлением 0,5%-ного раствора трипсина. Второй период жизни первичных клеток, начиная со 2-ой субкультуры, характеризуется постепенным замедлением роста. B это время осуществляется перестройка генетического аппарата клетки применительно к новым условиям жизни вне организма. Замедленному росту клеток во второй период более соответствует среда с пониженным до 5% содержанием сыворотки. Кроме того, для создания условий постепенной перестройки клеточного метаболизма и адаптации клеток к жизни in vitro заменяют среду частично — к 2/3 объема свежей среды добавляют 1/3 объема старой.

Регулярные пересевы клеток проводят после образования клетками монослоя через 7—

14 дней с использованием густого посева суспензии клеток 1: 2 или 1: 1. Этим исключается фаза дегенерации культуры. Первичные клетки получают возможность размножения, и тем самым увеличивается процент появления трансформированных клеток.

Через месяц наступает третья стадия в жизни культуры клеток — трансформация.

Этот период характеризуется множественным появлением колоний клеток полигональной формы среди монослоя веретенообразных, С наступлением трансформации метаболизм клеток повышается, что сопровождается быстрым подкислением среды.

Клетки не нуждаются больше в добавлении старой питательной среды, и ее исключают из обращения. Питательная среда содержит равные количества 0,5%-ного раствора гидроли5 затлактальбумина и среды 199, 10% сыворотки молодняка крупного рогатого скота, пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл.

Из шести попыток получения перевиваемых клеточных линий все были успешными. Клет10 ки культивируются в лаборатории более 2-х лет с постоянным сохранением своих свойств.

Способ получения перевиваемой культуры клеток, включающий культивирование первичной культуры на питательной среде с последующими регулярными пересевами клеток на

20 свежую среду через 7 — 14 дней, о тл ич а юшийся тем, что, с целью повышения вероятности появления трансформированных клеток, обладающих стабильным кариотипом, в процессе пересевов клеток, начиная со 2-ой и по25 следующих генераций клеток стадии замедленного роста, к свежей питательной среде добавляют до 1/3 — 2f3 ее объема среду предыдущего культивирования клеток до появления трансформированного роста всей культуры.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Гаврилов В. И. Перевиваемые клетки в

3S вирусологии. М., 1964, с. 49.

2. Каплина А. И. и др. Опыт получения перевиваемых клеток тканевых культур.— Труды Днепропетровского научно-исследовательского института эпидемиологии, микробиоло40 гии и гигиены им. Н. Ф. Гамалеи, 1962, т. 5, с. 65 — 68.