Способ получения туберкулина

Способ получения туберкулина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1 ок1.", с, .rQ», И 4,1

И Е iii 5в2745

ОП ИОАН

Союз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) ЗаявлЕно 190973 (2)) 1964669/28- 13 (51) р1 Кл 2

А 61 К 39/04 (23) Приоритет — (32) 28. 03. 73

Гац)(вратввнныв нанвтвт

Саввта Мвннатров СССР оа двлвм вэобрвтвннй в отнрытнв (») 34644/73 (33) Япония (43) Опубликовано 30.11.77. Бюллетень );". 44 (45) Дата опубликования описания 301277 (53) УДК

615372 (088. 8) Иностранцы

Тору цумита и Сенси .Кувабара (Япония) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Иностранная фирма Мицуи Фармасьютикалз, Инкорпорейтед (54 ) спОсОВ пОлучения туБеРкули)ТА

Изобретение относится к способам получения чистых белков, которые мо- гут быть использованы для диагностики туберкулеза.

Известен способ получения белка из туберкулезных бактерий путем отделения бактериальной массы от жидкости добавления буферного раствора и органических растворителей, автолиза бактерий, отделения нерастворимых продуктов автолиза и концентрирования препарата при помощи упаривания. .Однако такой способ не обеспечивает высокой степени чистоты целевого продукта.

С целью повышения степени, чистоты целевого продукта по предлагаемому способу органическим растворителем обрабатывают инактивированные клетки ggcobacteriuw tuberculosis штамм

Аоб «d. В и подвергают их действию нуклеазы, а фильтрат хроматографически очищают и выделяют целевой продукт кристаллизацией а

Способ осуществляют следующим образом.

Инактивированные клетки Иусоьас—

tat ium tubarcv Cosis обрабатывают

v 1 .органическими растворителями, например, кетонами, спиртами, карбоновыми кислотами, предпочтительно ацетоном, метанолом или уксусной кислотой. Эти растворйтели можно использовать вместе с водой. Клетки, обработанные растворителем, подвергают варке с нуклеазами, например с рибонуклеазами, дезоксирибонуклеазами. Водорастворимые белки выделяют из полученной смеси и подвергают диализу с применением буферов с рН 5,5-7,8, например, буфера (рН 7,0), содержащеro трис-(оксиметил)-аминометан и хлористый водород, а также этилендиаминтетрауксусную кислоту (рП 7,2), динатрийфосфат, монокалийфосфат. диализованные белки Фракционируют хроматографией и/или фьльтрованием через гель; пред,почтительнее хрома20 тография на колонке с применением ионооьменной целлюлозы или фильтрование через гель с применением.мостиковидносшитого декстранового полимера. Для фракционирования диализа25 тов используют ионообменную целлюлозу, например, аминоэтилцеллюлозу, диэтиламиноэтил (ДЭАЭ)-целлюлозу, триамино- этил (ТАЭ) -целлюлозу или эпихлоргидринтриэтаноламино (ЭХТЭОЛА)-целлюло30,зу.

582745

Диализованные белки элюируют буферными смесями.

Кристаллические туберкулиновые белки растворимы в воде, их молекуляр.ный вес составляет 3000-3500 в зави5 симости от клеток, применяемых для их получения. Кожные пробы на туберкулин показывают, что туберкулиновые белки обладают активностью в 10100 раз превышающей активность очищенных производных белков (ОПБ) на морские свинки, сенсибилизированные штаммом Аойама В или бациллой Кельметта

Герена (БКГ), инактивиэированных термообработкой микроорганизмов вида

Hl y co b ac teriu tuber c u Rosie.

Туберкулиновые пептиды получают гидролизом кристаллических туберкулиновых белков, фракционированием гид,ролизатов этих белков хРоматогРафией 20 или фильтрованием через гель.

Туберкулиновые белки подвергают гидролизу химическими или ферментативными способами. Химический гидролиз проводят с помощью минеральных кис- 25 лот, а ферментативный с применением протеолитического фермента, например, трипсина, химотрипсина, пепсина, папаина, бактериальных протеиназ, карбопептидаз Ли Ь. 30

Полученные гидролизаты фракционируют хроматографией на колонке, бумажной хроматографией, высоковольтным бумажным электрофорезом, фильтрованием через гель. Фильтрование через гель осуществляют с применением аммониевоацетатного буфера (pP. 5,9) через Сефадекс & 25 или KM-Сефадекс, пиридино-ацетатного буфера 40 (РИ 4,5) через СЗ-Сефадекс 0»-50, или пиридино-ацетатного буфера (pH 3,1).

Туберкулиновые пептидь представляют собой белые кристаллы, Растворимые 40 в воде, с молекулярным весом 5003000. Кожные пробы на туберкулин показывают, что туберкулиновые пептиды обладают более высокой, чем ОПБ, активностью, на морские свинки, сенси- 60 билиэированные штаммом Аойа»а В или

БКГ, микРоорганизмов Mgcobacterium

tubercu(1Osi6 инактивированных термообработкой.

Пример 1. Культивированные

55 клетки (100 r) штамма Аойама В Мц—

coЬact erium tuЬercu osis инактивируют термообработкой при

120 С в течение 30 мин, Клетки выделяют из культуральной среды фильтрова- Е нием, затем их разрывают посредством звуковой обработки и обрабатывают ацетоном. Полученный остаток подвергают варке с рибонуклеазой и дезоксирибонуклеаэой, и вываренную смесь центрифугируют для отделения водорастворимых белков Полученные водорастворимые белки диализуют с применением 0,001 _#_ раствора буфера на трис-(оксиметил) — аминометане и хлористом водороде (РП 7,0), содержащего

0,0001 М раствор этилендиаминотетрауксусной кислоты.

Полученный диализат хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюирование проводят в среде, содержащей хлористый натрий. Весь активный туберкулин содержится во второй белковой фракции.

Последующую хроматографию на Сефадексе 6- 2pp проводят аналогично, и продукт фракционируют на три фракции.

Весь активный туберкулин содержится в большей фракции.

Активный туберкулин,кристаллизуется спонтанно при выдерживании раствора при 4 »С в смешанном растворе того же буфера с очищенным ацетоном. Из

100 r клеток (мокрый вес) штамма

Аойама В микроорганизма вида YtycоbacteriuIII tube,rcuKosis получают 25 мг кристаллического туберкулинового белка.

Туберкулиновый белок, полученный по этому способу, состоит из 89 остатков аминокислот, расположенных в следующем порядке:

1 е 3„4 5

Н8Х -Арг -Лев -Ae»I -Ace- Ас

6 8 9 10 1

-Пере - 11ро- Глу — Вал -А118-..Цис68 70 71 72 и —...Кис —...Асп -Гли-Сер-Глу88 88

-Hem — ...Ала -Лиз — СООН

Кожная проба на туберкулин показывает, что полученный туберкулиновый белок обладает активностью в 100 раз превышающей активность ОПБ на морские свинки, сенсибилизированные штаммом Аойама В или ГКГ, инактивированных термообработкой.

Пример 2. Получают белок с активностью туберкулина, с молекулярным весом 13 500 из Г>КГ по методике, описанной в примере 1.

Порядок расположения аминокислот этого туберкулинового белка, состояще . го из 135 остатков аминокислот: К-концевые и С-концевые аминокислоты, а также первичная структура в основном такие же, что и у белков штамма Аойама В, инактивированпых термообработкой.

Кожные пробы на туберкулин показывают, что активность этого туберкулинового белка почти соответствует активности белка из штамма Аойама В, инактивированных термообработкой; микроорганизмов MцсОЬас eriurn Ео582745

Формула изобретения.

Составитель С. Малютина

Техред A.Áoãäàí Корректор A. Лакида

Редактор Н. Хубларова

Заказ 3645/713 Тираж 677 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

0 cutosia на морские свинки, сенсибилиэированные инактивированными термообработкой шФаммами Аойама В или БКГ.

Пример 3. Кристаллический туберкулиновый белок, полученный по методике примера 1, подвергают ферментативному гидролизу при 37 С в течение

6 ч с применением 1%-ного раствора триц при рл 8,4. Двухраэмерный высоковольтный бумажный электрофорез полученного гидролизата проводят при

75 В/см в пиридино-ацетатном буфере (РН 4,5), после чего хроматографируют на бумаге в смеси бутанола, уксусной кислоты и воды (4 : 1 : 4 по объему).

Проявление приводит к отделению некоторых активных пептидов, один из которых представляет собой пентапептид со следующим порядком Расположения аминокислот: и 3 4 5

M>N-Асп-Гли-Сер-Глу-Мея-СООТГ.

Выделен также нонапептид с молекулярным весом 950. 25

Кожные пробы на туберкулин показывают, что активность этих туберкулиновых пептидов составляет 1-10% по отношению к активности исходного туберкулинового белка. 30

Пример 4. Кристаллическиг туберкулиновый белок, полученный по методике примера 1, подвергают гидролизу в 0,5%-ном растворе химотрипсина.

Полученный гидролиэат хроматографируют на колонке, заполненной Сефадексом G-25, причем элюирование проводят аммониевоацетатным буфером при

РН 5,9. Полученные пептиды с активностью туберкулина затем фракционируют пиридинацетатным буфером (pH 3,1) на колонке, заполненной довексом

1-Х2 . Полученный туберкулиновый пентапептид имеет такую же структуру, как пептид, полученный по методике примера 3.

Пример 5. Туберкулиновый белок, полученный по методике примера

2, обрабатывают, аналогично примеру 4.

Получают такой же туберкулиновый пентапептид, как полученный по методике примера 3.

Способ получения туберкулина путем обработки клеток Mgcobacte ivm tvbercv3osis органическим растворителем, а затем ферментом, отделения нерастворимых примесей и выделения целевого продукта из фильтрата, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения степени чистоты целевого продукта, органическим растворителем обрабатывают инактивированные клетки Hgco—

Ьас1er(urn tubercuLOs05 штамм Аойама В и подвергают их действию нуклеазы, а фильтрат хроматографически очищают и выделяют целевой продукт кристаллизацией.