Способ получения деацетоксицефалоспорина с

Способ получения деацетоксицефалоспорина с

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

> чв

Оп ИСАЙИ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11)582772 (61) Дополнительный к патенту (5lj М, Кл. (22) Заявлено 25D473 (21) 1920728/28-13

1 ° (23) ПриоритЕт (32) 26.04 . 72.

247608; 247667;

247668; 247669; t ")

348341 (43) Опубликовано 30,1177 Бюллетень № 44

С 12 3 9/00

Государственный квинтет

Саввтв етнннстрав СССР во делам наваретенкй к PTKptBNII (53) УДК 615 ° 779.932 (088 ° В ) (45) Дата опубликования описания 27,1277

Иное транцы

Роберт Л.Хамилл и Калвин Юджин Хиггенс (CUlA) (72} Авторы изобретения

Иностранная фирма Эли Лилли Энд Компани (СШа} (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕАЦЕТОКСИЦЕФАЛОСПОРИНА С

ОН

11 ()®. -(И-(Мв) 3-С- М

МЯ. О выби- с,тпвт ice Иоре1е вр. 3%1t1 5446, Era е ice(8opsis вр ЭИЬ1 5713, Е.тпоrice_#_o йа sp. NRQ Ь 5714 или ,„) EnmriCe_#_opeie ьр. Я КЬ 5717.

Из рода $Copu(,arioysiS выбирают штамм Scopulari opsis sp. NR.Х!, 5715, из рода paeci(omqces выбирают штаммт Paec i fo тп цсея car acus

NR RL 5711, а из рода 1)(.hete—

rospora выбирают штамм 0Жет,егвврот а

chfamidospara ARRL 5728

Предлагаемые штаммы известны, опи30 саны в литературе и их используют 3

C6QK

Изобретение относится к микробиологической промьааленности, а именно производству антибиотиков.

Известен способ получения деацетоксицефалоспорина С химическим путем (1) .

Однако такой способ сложен и трудоемок.

С целью упрощения способа получения деацетоксицефалоспорина С формулы шт амм — пр одуцент пенициллина М относящийся к роду Cephatosporium, 3rnericeh(opsis, Scopufa riopsis

PaBci f o òï ö s es или Q iket егоs po ra культивируют в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные со.ти, а затем из культуральной жидкости выделяют целевой продукт.

Из рода СерЛа(оврог(.отп. выбирают штаммы

dephafosporivm corda MRRÕ, Cephafosporium Йтцьоо епнт NCQ

Cephatosporium sp, е(Я.Ю.

Cepha1osporium sp. ИМИ

Ceps(osporium sp.16ЦИ.

Lep4cLLospQl (.0тп sp КЙВ}.

Ceph,afosporium ьр МЙ.Я.Ь

Cepl1afosporium sp. МКК(.

4 ep ka c os p от i 0 тп sp ° М яЩ

Qepha(osporium. ьр. МКК1

Сер а(оаротч нтп sy, в(Мл.

Cepkatospor sp. Ккйт.

Иэ рода Entericегоpsis рают штаммы:

5445, 146 15, 5712., 5716, 5718, 5719, 5720, 5721

5722

5723, 5724 или

5725.

582 772 для получения пенициллина N (цефалоспорина М ).

Предлагаемые штаммы культивируют при перемешивании в колбах емкостью

1 л и получают небольшое количество деацетоксицефалоспорина С. Для получения большого количества штампы культивируют в ферментерах больших размеров в условиях глубокой аэробной ферментации.

Для получения деацетоксицефалоспорина С споры организма выдерживают на косом агаре. Споры с косого .агава используют для lipBBHBKB растворителей среды небольшого объема.

Вегетационную среду выдерживают в термостате до получения обильной растущей культуры микроорганизма. Эту вегетационную среду затем используют в качестве прививочного материала для ферментационной среды, применяемой в больших количествах.

В некоторых случаях дополнительно вводят вегетационную среду в качестве прививочного материала для ферментационной среды. Такую вторичную вегетационную среду обычно используют, если объем ферментационной среды значительно больше объема первой вегетационной среды. Вегетационную среду большого объема затем вносят с подходящей концентрацией микроорганизма для инициирования начинающейся ферментации в ферментерах больших размеров. Вегетационная среда может иметь такой же состав, как и ферментацнон- ная или она может содержать дополнительные компоненты для роста и развития микроорганизмов.

Образование деацетоксицефалоспорииа С происходит при рН от 6,2 до

8,0, предпочтительно рН 8,5-7,5.

Культивацию ведут при температуре

30-35 C. Оптимальный выход деацетоксицефалоспорина С происходит при температуре 26 С.

Максимальный выход деацетоксицефалоспорина С при культивировании штамма в больших емкостях происходит в течение 4-7 дней, но если культивирование велут в колбах емкостью

1 л, то штамм растет гораздо быстрее и продуцирование деацетоксицефалоспорина С происходит за 2-3 дня.

Если рН ферментативной среды достигает 8,0 или выше, то это неблагоприятно влияет на выход деацетоксицефалоспорина С, поэтому необходимо контролировать время и значение рН ферментационной среды в процессе ферментации. рН среды понижают добавлением в ферментационную среду подходящей кислоты или подходящего буфера.

Присутствие деацетоксицефалоспорина С в ферментационном бульоне определяют хроматографией, а также посредством бноавтографов. Б качестве

16 й6

Ю

65 определяющего организма для биоавтографов используют Рыойогпапоз ь01аддсМйа

Стерильный воздух пропускают через культуральную среду для повышения выхода деацетоксицефалоспорнна С.

Объем воздуха, проходящего через культуральную среду, составляет

0,2 об.ч. воздуха и 1 мин на 1 объем культуральной среды.

Для извлечения деацетоксицефалоспЬрина С из ферментационной среды обрабатывают весь ферментационный бульон короткое время в кислой среде для разложения некоторых из сопутствующих примесей.

Деацетоксицефалоспорин . С отделяют от других компонентов ферментационной среды хроматографией на ионообменной смоле, а затем очищают хроматографией на целлюлозе или силикагеле с последующим осаждением и перекристаллиэацией.

Сначала отфильтрованный ферментационный бульон подвергают предварительной очистке экстракцией органическим растворителем, не смешивающимся с водой, например н -бутанолом или амилацетатом, с целью удаления примесей. Экстрагированный бульоН подвергают очистке хроматографией на активированном угле, и колонну промывают водой для удаления водорастворимых окрашенных примесей и водорастворимых неорганических веществ. Продукты ферментации затем элюируют из угля 50%-ной смесью ацетона с водой.

Элюат концентрируют до водной фазы, которую затем хроматографнруют над основной анионообменной смолей.

Смолы используют гидроксильного, ацетатного или формиатного типа, полистирольные смолы типа четвертичного аммония или других подходящих типов.

Концентрированный элюат, поступающий из колонны с активированным углем, выливают на анионообменную смолу, после чего смолу промывают водой.

Деацетоксицефалоспорин С элюируют иэ обменной смолы в виде соли с подходящим слабым основанием, например, при использовании колонны со смолой ацетатного типа в качестве элюирующего растворителя применяют водный раствор ацетата натрия в концентрации 1 н. или менее. Для предотвращения образования избытка неорганической соли (ацетатнатрия) в элюате из Ьбменной колонны, концентрация ацетата натрия должна быть 0,10,5 н.

При и спол ьз о ванин о бме н ной смолы формиатного или другого подходящего типа используют соответствующую соль в 1 н. растворе в качестве растворителя для элюирования, например, формиат аммония. Многочисленные фрак582772

Пример 1. Отделенные споры штаммов Сьpha.(.osyorium sp. МКРЛ

5445, Cepha.f os orium cher sogenum

ОТСО 14 615, Етиеi iced (opsis sp. Хйй.(.

5446 и EmericeÈoðsis sp. уря(5447 по отдельности прививают на косой агар со средой следующего состава, Ъ:

Лактоза 1, 000

Глицерин 1,000

Соевый пептон 0,250

Растворимые высушенные кукуруза и солод 0,250

Гептагидрат сульфата магния

Гептагидрат сульфата двухвалентного железа 0,001

Карбонат кальция 0,200

Раствор микроэлементов 0,625

Агар 2,000

Вода Остальное

Косой агар термостатируют 7 дней при температуре 26О С. Зрелые культуры заливают стерильной дистиллированной водой и осторожно соскабливают стерильной палочкой для получения споровой суспензии.

80 . Полученные споровые суспензии применяют для прививки двух отдельных стерильных вегетационных сред следующего состава,Ъ:

Соевая мука 2,000

35 Солодовый экстракт 2,000

Кукурузный экстракт 0,500

Гептагидрат сульфата магния

Монокалийфосфат

40 Дикалийфосфат

Дигидрат хлорида кальция 0,010

Раствор микроэлементов

Вода

0,050

0,025

О, 100

0,050

0,625

Остальное

0,3

2,0 ции собирают, и фракЦии, содержащие деацетоксицейалоспорин С, соединяют

Соединенные элюаты хроматографируют над активированным углем для удаления избытка неорганических солей, например, ацетата натрия, применяемого в виде элюирующего раствора, Колонну с активированным углем промывают водой для удаления неорганических водорастворимых солей, и деацетоксицефалоспорин С элюируют из колонны 50Ъ-ной смесью ацетата с водой. Элюат упаривают досуха или упаривают до удаления ацетона, а концентрированный водный раствор лиофилизируют и получаютдеацетоксицефалоспорин С в виде неочищенного твердого продукта.

Неочищенный продукт деацетоксицефалоспорина С подвергают дальнейшей очистке хроматографией над целлюлозой или силикагелем или над другим подходящим неионным адсорбентом. Деацетоксицефалоспорин С элюируют из колонны растворителем, содержащим ацетони-. трил и воду (80:20), и собирают многочисленные фракции. Фракции, содержащие деацетоксицефалоспорин С, определяют бумажной хроматографией, соединяют и концентрируют до небольшого обьема или досуха. Высококонцентрированный водный остаток или сухой остаток растворяют затем в минимальном количестве изопропилового спирта, и спиртовой раствор выливают в большое количество диэтилового эфира.

Очищенный деацетоксицефалоспорин С получают в виде соли, соответствующей водному злюирующему средству, применяемому для элюирования анионообменной смолы. Например, при использовании ацетата натрия в качестве элюирующего средства получают деацетоксицефалоспорин С в виде мононатриевой соли.

Деацетоксицефалоспорин С в форме соли отфильтровывают и высушивают.

Соль деацетоксицефалоспорина С можно превратить в свободную кислоту, например, пропусканием через катионообменную смол„ . 50

Хроматографию для идентификации деацетоксицефалоспорина С в неочищенных ферментационных бульонах или во фракциях элюатов смол осуществляют на хроматографической бумаге ватман М 1 по восходящему методу. Система растворителей, применяемая для проявления, состоит из ацетонитрила и воды (80:20 об.ч.); камера насыщена парами растворителя следующего состава: п -пропанол — пиридин уксусная кислота;ацетонитрил-вода в соотношении 45:30:9:40:36 (об.ч.), С целью упрощения хроматограФии испытуемый образец предварительно обрабатывают пенициллиназой. 65

Перед автоклавированием доводят рН среды до 6,5. Привитые вегетационные среды термостатируют 48 ч при

26 С с применением вращающегося аппарата для взбалтывания. Затем эти среды используют в качестве прививоч. ного материала для ферментационной среды при соотношении 1Ъ вегетационной среды на 1 об.ч. Ферментационной.

Применяемые для этой цели среды имеют следующий состав, Ъ:

Сахароза 4,0

Глицерин 1,0

Глутамат натрия 0 5

Арахисовая мука 2,0

Гексагидрат двойного сульфата аммония и двухвалентного железа

Нитрат калия

582772

Карбонат, кальция О, .

Вода Ост альнсе

При ферментации большого количества продукта используют поверхностноактивные вещества или антивспениватели. Перед стерилизацией доводят рН среды до 6,5. Затем непривитые ферментационные среды термостатируют

5 дней при 26 С и при перемешивании.

Во время ферментации через ферментаЦионные среды пропускают воздух со скоростью 1/2 объема на 1 объем культуральной среды в 1 мин. Конечное значение рН ферментационных сред

7,5. 15 л полученного бульона подкисляют до рН 2 серной кислотой. Подкисленные цельные бульоны перемешивают

1 ч при комнатной температуре, после чего подщелачивают до рН 6,0 раствоюом гидроокиси натрия.

Бульоны отфильтровывают, и водный фильтрат экстрагируют и -бутанолом для удаления нерастворимых веществ в суспензии. Затем водные фазы пропускают через колонны, заполненные активированным углем, и колонны промывают дистиллированной водой. Элюаты промывных вод отбрасывают. Далее колонны элюируют 50%-ным водным ацетоном. Элюаты упаривают под вакуумом до водной фазы, которую хроматографируют в колоннах, заполненных полистирольной смолой, содержащей группы четвертичного аммония и ацетатного типа. Колонны сначала промывают водой, и промывные воды удаляют.

Активные продукты ферментации элюируют иэ колонны 0,15 н. раствором ацетата натрия. Многочисленные фракции собирают, и фракции, содержащие деацетоксицефалоспорин С, соединяют.

Присутствие деацетоксицефалоспорина С во фракциях элюатов определяют хроматографией восходящим методом с применением бумаги ватман Р 1.

В качестве элюирующего растворителя применяют смесь ацетонитрила с водой (80:20). На дно хроматографической камеры наслаивают смесь растворителей, содержащую 300 мл раствора состава, Ъ: и -пропанол 37,5, пиридин 25, уксусная кислота 7,5, вода .30, который разбавляют до 100 мп ацетонитрилом.

Деацетоксицефалоспорин С определяют также при помощи микроорганизма вида Pseudomoeog sofancearcuw.

Полученные фракции деацетоксицефалоспорина С после хроматографии соединяют. Объединенные фракции абсорбируют на колонне, заполненной активированным углем. Колонну сначала промывают дистиллированной водой для удаления растворимых неорганических веществ, например ацетата натрия, а затем элюируют 50Ъ-ным яс:,— ным раствором ацетона. Элк.ат, ларявают под вакуумом досуха. Получают неочищенный твердый препарат натриевой соли деацетоксицефалоспорина С, который очищают хроматографией на колонне, заполненной целлюлозой..

Антибиотик элюируют иэ колонны с целлюлозой смесью раствсюителей. содержащей ацетонитрил и воду (80:20).

Многочисленные фракции собнрают, и при использовании хроматографической системы, описанной выше, фракции, в которых обнаружен цефалоспорин С, соединяют. Соединенные фракции концентрируют досуха, а сухой остаток, содержащий деацетоксицефалоспорин С, растворяют в минимальном количестве иэопропанола. Спиртовой раствор выливают в эфир, количество которого превышает в 20 раз объемное количество иэопропанола. При перемешивании образуется осадок натриевой соли деацетоксицефалоспорина С. Его отфильтровывают и высушивают иа воздухе. Получают 126 мг антибиотика в

25 виде натриевой соли.

Пример 2. По методике, описанной в примере 1, споры Етпь (сЕИОрс(s sp. ККЯ.L, 5714 культивируют на вегетационной среде. Культуральная среда, применяемая для прививки продуцирующей среды, имеет следующий состав, Ъ."

Растворимый крахмал 1,0

Декстроза 4,0

Соевая крупа 1,0

Карбонат кальция 0,5

Антивспениватель 0,1

Вода Остальное

40 Перед автоклавированием и прививкой.доводят рН продуцирующей среды до 6,5. Ферментацию проводят 5 дней при 26 С. Деацетоксицефалоспорин С извлекают и выделяют согласно при45 меру 1.

Пример 3. Аналогично примеру 1 споры ссору(аг(орь(ь sp NRk(5715 культивируют на вегетационной среде, описанной в примере 1. Вегеж тационную среду применяют для прививки ферментационной среды, состав которой также описан в примере 1.

Ферментацию осуществляют 5 дней при 26 С, и деацетоксицефалоспорин С

5» извлекают из ферментационной среды согласно примеру 1.

Пример 4. Аналогично примеру 1 проводят культивирование и ферментацию Р(16г-((от у С es с получением деацетоксицефалоспорииа С.

Пример 5. По той же методике культивирования и выделения, а также с использованием среды, описанной в примере 1, выращивают Dehetегоsyora

-h.i .а ну с(оър о (а с получением

85 деацетоксицефалоспорина С.

582772

О

СЕ phatOSparium KOrda NRR L

Cepkalo sporium сЬ gsogenurn

Cephafosporiurn sp. NkkL

Сеphafosporivrn р. NRkt

Cephafosporiun ьр NRRL.

5445, ATCC 146 15, 5712, 5716, 5718а

Составитель С.Малютина

Редактор Н.Хубларова Техред З,Фанта Корректор Л.Небола

Заказ 3654/714 Тираж 541 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035 Нсгкна Н-а" ааянгкая наа. а, 4 5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4

Формула изобретения

1. Способ получения деацетоксицефалоспорина С формулы отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, штамм— продуцент пенициллина g ., относящийся к роду Cepha(osporium

Scopu fario psi. Z, Emery ñå (fopsi s, Раесi 0оъчцсеь . Q ihetегоsporo культивируют в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, а затем из культуральной жидкости выделяют целевой продукт.

2. Спсооб по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что из рода Qepha(osporium выбирают штамм:

Cepkaiosporium sp. NRRL 5719, СерЕat. osporiurn sp. NLRL 5720, epha Cosporium sp. MRRL 5721, Cephaposporium sp. ХМ -. 5722, Cephafosporium sp MRRL 5723, СерИа(о рог„.ом ьр Кр1 5724 или

Cephafospoyiurn sp. +RRL 5725, из рода Eme rice Иорsis выбиоа)О ют штамм:

Emericeftopsis sp. NRRL 5446, Етпег се (opsis sp. NRRL 5447, Emerice_#_opsis эр ARRL

Emericeffopsis ьр. NRRL 5714 или

EmericefkoPsis sP. NRRL. 5717, из Рода Scopufarioysis выбирают штамм Б сор ufariop sis зр. яКК Ь

5715, иэ рода PaeCifOmqceS выбирают штамм Раеcifomiices саг—

_#_ ebs NRRt 5711, из рода Diketеrospora выбирают штамм Dihetегоspor

ra cubi amqdospora ККРМ 5728.

Приоритет по пунктам и признакам:

26.04.72 по п. 1 и по признакам оя и. 2, касающимся использования штаммов 5445, 14615, 5446, 5447;

09.04,73 по остальным признакам п.2.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

Патент США 9 3124576, ил ° 260-243, 1964.