Патент 583641

Способ получения -лейцина

 

О1 И С..А".Ц И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ е е

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 58364 j

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено 26.07.76 (21) 238763 4/28-13 (51) М. Кл. с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет— (43) Опубликовано15»07 78.Ьюллетень № 26 (45) Дата опубликования описанияОХб 78

С 12 23 13/06

Государственный комитет

Совета Министров СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК 668.394 (088.8) Н. И, Жданова, Т. В. Леонова и Л, Ф. Козырева (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленнь1х микроорганизмов (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L -JTEAIIMHA

Изобретение относится к способу получения L-лейцина при выращивании продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде в микробиологической промышленности и используется также в качестве питательной добавки к пищевым продуктам и корму животных и как компонент питательных смесей и реактивов в медицине, фармацевтической и химической промышленности.

Известны способы получения L-лейцина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов из рода Brevibacterium и Coryneb act епшп (1), (2) .

В этих способах в качестве продуцентов

L-лейцина применяют мутантные штаммы микроорганизмов Cor. glutamicum, Br. flavum, Cor. acetoacidophiIum, Br. lactofermentum, генетические свойства которых обеспечивают сверхсинтез L-лейцина и накопление его в питательной среде, а именно: относительную потребность для роста в изолейцине, метионине, фенилаланине, валине или их смеси; резистентность к антагонистам лейцина, в частности 2-тиазолаланину и 4-алазейцину; сочетание потребности для роста в треонине, изолейцине и метионине с резистентностью к ретроингибированию лейцином и его антагонистами, в частности 2-тиазолаланином и ф-оксилейцином, фермента 1 а-изопропплмалатсинтетазы.

11рп получении указанных мутантных штаммов в качестве исходных штаммов были использованы штаммы дикого типа, известные как продуценты глутаминовой кислоты.

Уровень накопления L-лейцина известнымп штаммами составляет 4 — 22,1 г/л, причем наиболее продуктивными являются му10 танты, отселекционированные антагонистами лейцина, синтез которых сложен, а их стоимость значительна.

В известных способах в питательные среды необходимо в качестве источников роста

15 дополнительно вводить различные гидроlHзаты белка, в частности соевой муки, микроб ной массы, казеина, а также эксгракты дрожжей или печени.

Наиболее близким решением к описываегю мому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения L-лейцина путем глубинного выращивания продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium flavum на питательной среде, содержащей в качестве источни2g ка углерода углеводы, источник азота, ми5836М неральные соли и источник рс>стовых вешест в (3) .

Однако такой способ сложен, так как требует использования дополнительного o()0рудования для гидролиза белковых продуктов, и дорогостоящий за счет использова- 5 ния в селекции штамма-нродуцента дорогих реактивов (антагонистов лей цина).

С целью унрощения и удешевления способа предложено из микроорганизмов Brevibacterium flavum использовать штамм !р

ВНИИгенетика — 758, при селекции которого не применяют антагонистов лейцина, а отбирают первичный продуцент среди ревертантов .к гомосериннезависимости у штамма- продуцента-лизина и затем вводят отобранному ревертанту мутацию зависимости от витамина Вlz (или метионина), что позволяет при культивировании этого штамма и получении лейцина использовать в питательных средах в качестве источника ростовых веществ кормовой концентрат витамина B,ë или кормобактерин.

Способ заключается в следующем.

Культуру штамча Brevibacterium flaiпш

ВНИИгенетпка — 758 выращивают на а-аризованной среде Хот1ингера. затем выссвают в предварительно простсрилизованные вместе со средой колбы на мясопептонный бульон для выращивания посевного материала. После засева культуры колбы устанавливают на круговой качалке с 220 ——

240 об/мин при 30 С.

Готовый посевной материал вносят в колоы с ферментационной средой, содержащей исто шики углерода, азота, ростовых веществ и Iuucpa,aüíûc соли, при этом в качестве источника ростовых вешеств испо;Ib зуют кормовой концентрат витамина В i пли кормобактерин.

Все кочпоненть1 среды стерилизуют uo„I, давленисм, рН cpe b ;Lîaîä ï до заданной до и пос те стерилизации.

Фермсптацпю проводят на указанной вы40 ше качалке при 30 C.

После образования L-лейцина его ссдер>к ание определяют м етодом тонкослойной хроматографии на пластинах «Siluf ol ».

Прил ер 1. Культуру штам ма В rev ib acterium flavum ВНИИгенетика — 758 выраши- 45 вают 24 ч при 30 С на агаризованной среде Хоттингера, затем петлей высевают в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащие 30 — 100 мл мясо-пептонного бульона., включаюшего ком поненты, вес. /p. мясная вода и пептон 1,0; NaCI 0,5; сахароза 1,0.

Колоы вместе со средой предварительно стерилизуют в автоклаве при 0,8 атм 30 чпн. !!осле засева культурь1 колбы устанавливают на крмговую качалк с 220 — 240 ос!/мин

55 и вырашивают посевной материал 16 ч при

30 С. Готовый посевной материал вносят 3

10О/р (по объему) в колбы Эрленмейера ечкостью 750 мл, содержащие 30 мл фермс нтационной среды, состава, г/л: сахароза 100; (NH, ) SO, 30, КН,РО, 1,5; Мд8О, 0,5; бс

Ca(.О, 40; биотип 100 мкг,л илп дестпоиотин 300 мкг/л; кормовсй концеuTpaT витамина В, 5,0; водопроводная вода.

Все компоненты среды стерилизуют при

0,8 атм 30 мин, рН среды доводят после стерилизации стерильным 25 /o-ным раствором Н 80л до 7,5.

Ферментацию проводят на указанной выше качалке при 30 С.

После 60 ч в культуральной жидкости ооразуется 3,7 г/л L- лейцина, содержание которого определяют методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Silufol» после разгонки в течение 1,2 ч в системе растворителей: этилацетат, изопропанол, аммиак, вода в соотношении 20:20:1,5 — 25 и обработки

0,5О/ц-ным раствором нингидрина в ацетоне.

П1>и,яер 2. Культурой штамма-продуцента, вырашенной на агаризованной среде согласно примеру 1, засевают колбы емкостью

750 мл, содержащие 30---100 мл посевной среды следующего состава, г/л: сахароза 30; (ХН4) ISO: 15; КН РО:. 0,8; МОЯО., 0,2; кукурузный экстракт !О (по сырому весу); кормовой концентрат витамина В лс 10; водопроводная вода. рН среды до стерилизации доводят раствором NaOH до 7,6--7,8, стерилизацию среды проводят согласно примеру l. рН среды после стерилизации 7,0

7,2.

Посевной материал вырашивают на качалке при 30 C 20 ч, засев ферментацпоппых колб и ферментацию проводяI на среде и при режиме согласно примеру 1. После 65 ч в культуральной жидкости образуется

13,2 г/л L-лейцина, определяемого согласно методике примера 1.

П/>илльер >. Выращивание посевного материала проводят согласно примеру 1. В составе ферментационной среды по примеру

1 кормовой концентрат витамина В i заменяют 5 г /л кормобактерпна.

Режим стерилизации, засев фсрментационных колб и условия ферментации аналогичны uðèмсру 1.

После 72 ч культивирования образуется !

0,0 г/л !.-лейцина, который опрсдсляют согласно методике примера 1.

Пример 4. Выращивание посевного материала проводят по примеру 1.

В составе фсрменгационной среды примера 1 кормовой коьск нтрат витамина В i p заменяют на 100 мкгл чистого препарата витамина В, и 200 мкг, л чистого препарата витамина В (тиамина). Все остальные условия аналогичны примеру 1.

Культивируют 72 ч, в культ ральной жидкости образуется 10,9 г/л L-лсйцина, определяемого по методике примера 1.

При.яе/> 5. Выращивание посевного ма; териала проводят согласно примеру .

В составе ферментацио шой среды по примеру 1 кормовой концеllTpàò витамина

5836 Ц1 формула изобретения

Составитель А. Бражникова

Техред О. Луговая Корректор А. Гриценко

Тираж 568 Подписное

Редактор П. Горькова

Заказ 3938 46

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4 го

В зам еняют на 200 мкг/л витамина В и 300 мкг/л метионина.

Все другие условия аналогичны примеру 1

Кул ьтивируют 72 ч, получают 12,3 г/л

L-лейцина в культуральной жидкости.

Содержание ле йцина определяют согл асио методике примера 1.

Описываемый способ получения L-лейцина по сравнению с известным дешев, так как не требует применения дорогостоящих реактивов и вместо чистых препаратов витаминов Bi и В г в питательных средах могут быть использованы сухие кормовые концентраты, например кормовой концентрат витамина Bi или кормобактерин, и метионин, являющийся продуктом химического синтеза и выпускаемого в качестве кормовой добавки для использования в животноводстве.

Описываемый способ прост, так как не требует прим енения оборудования для гидролиз а бел ковы х продуктов.

Способ получения L-лейцина путем глубинного выращивания продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium flavum на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы, источник азота, минеральные соли и источник ростовых веществ, отличающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, из микроорганизмов Brevibacterium Папгп исполь10 зуют штамм ВНИИгенетика — 758, требующий для своего развития витамин Bi> или метионин, при этом в качестве источника ростовых веществ используют кормовой концентрат витамина В г или кормобактерин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент США № 3668073, кл. 195 — 29, 1972.

2. Патент Франции № 2264088, кл. С 12 D 13/06, 1975.

20 3. Патент США № 2264088, кл. С 12 D 13/06, 1975.