Способ получения антибиотического комплекса

Способ получения антибиотического комплекса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Реслублик (11}584800

К ПАТЕввТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено,050376 (21) 2328364/28-13 (51) М. Кл.

С 12 О 9/14 (32} 08. 03 . 75 (23} Приоритет (31) Р 25 10 160 4 (33) ФРГ

P 25 10 161.5 тввудврвтввивва ввивтвт

Свввтв ВЬнввтрвв СССР вв двлам взвврвтвнвв в втирктвй (43) Опубликовано 151277. Бюллетень №46 (53) УДК 615.779

° 931(088.8) (45) Дата опубликования описания 1001..78

Иностранцы

Клаус Бауэр, Вернер Фраммер, Вильфрид Кауфманн, Карл

Георг Метцгер, Мартин Шеер, Дельф Шмидт, Тео Шредер и Дитмар Шефер (ФРГ)

Иностранная фирма Байер АГ (ФРГ) (72) Авторы втзобретевия (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к области медицины, в частности к получению новых антибиотиков.

Предложенные антибиотики новые, . и в научно-технической и в патентной 5 литературе не описаны.

Для проведения предлагаемого способа используют. новые штаммы .

АсЬ|орВаев SL-73 и Aatinophsnes 5Е-73)а .

Штамм Асйаорбизез SE -73 выделен из 10 почвы. Штамм Actinopbmes 5E-73/8 был получен как спонтанный мутант

1 штамма, $Е-73,.и отличается от последнего поэышенным выходом антибиотиков . Штамма ) сй порбнчеэ M-7> Ь и Д - 73/В зарегистрированы в коллекции АТСС под номерами АТСС Ит

31058 и ATCC- Ит 31060.

Штаммы характеризуются следуницими культурально-морфологическими и фи- 20 эколого-биохимическими признаками °

Культурально-морил гические признаки. Мицелий диаметром 0,3 до 1,3 мк, разветвленный. Спорангин имеет неравномерную форму,. контур в большинстве случаев приблизительно шарикообраэный, однако с неровной поверхностью и с диаметром от 5 до 18 мк °

Споры шарикообразны до эллиптических, снабжены жгутиками, имеют большую под-З) вижность и диаметр от 0,7 до 1,3 мк.

В спорангии они расположены в виде изогнутых цепей.

Признаки культур на различных питательных средах (по истечении

24 дней при температуре от 20 до

30 С) .

Агар Чапека. Рост от хорошего до очень хорошего, субстратный мицелий оранжевый, растворимый пигмент слабо-коричнево-желтый, образует спо-. рангии, поверхность мицелия тонко покрыта инеем.

Агар казенно-пептон Чапека (СРС).

Рост от хорошего.дд очень хорошего.

Субстратный мицелий от оранжевого до оранжево-коричневого, растворимый пигмент коричневый, образует спорангии, поверхность мицелия тонко покрыта инеем.

Молочный агар. Рост от хорошего до очень хорошего, субстратный мицелий оранжевый, растворимый пигмент золотисто-коричневый, образует спорангии, поверхность мицелия тонко пок" рыта инеем, каэеин пептиэирует.

Тирозин-агар. Рост от умеренного до хорошего, субстратный мицелий коричневый, растворимый пигмент коричневый, спорангия не образует, поверх584800 ность мицелия частично тонко покрыта инеем, кристаллы тирозина не растворяет.

Физиолого-.биохимические признаки.

Растет при 20-40 С> оптимум роста

Ф

28 С.

Отношение к источникам углерода.

Усваивает крахмал, декстрин, сахароэу, мальтозу, глюкозу, лактоэу, сорбит, глицерин.

Иолоко пептонизирует. Обраэуей меланин.

Спобоб получения антибиотика Заключается в том, что штамм .ЙЧао рбнме SK"7ЦВ ) и/или ЛййорЬжмв 86-.7МВ выращивают на питательной сраде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 20-40 С и рН 6,0-8,0 с последующим выделением аитибиотического комплекса и разделением его на антибиотик A и 8.

1. Культивирование

Иицелий штамма, выращенный на скошенном агаре состава, вес.Ф:

Пептон 0,25

Казеин-гидролизат, кислый

0,1

К НРОвзн О

0,01

Нейтральный многоатомный спирт, мл

3,0 Тростниковый сахар

Ax Rp

Вода водопроводная

2,0 до 10Q помещают в литровые колбы ЭрленмейЕра с посевной средой следующего состава, вес.Вг

Соевая мука, обезжиренная 3

Глицерин повышенной чистоты

Вода водопроводная

Р,о 100

С целью пеногашения н среду добавляют нейтральный многоатомный спирт в количестве 1 капля на 140 мл питательной среды и культивируют в течении 8 дней на качалке при 2Р C.

Ферментационная,среда имеет следующий состан, вес.Ъ|

Декстрин 0,4

Глицерин 0,2

Дрожжевой экстракт 0,2

СаСО, 0,2

Водойронодная вода до

Нейтральный многоатомный спирт, спирт, мп 5

8 л среды переносят н стеклянные ферментеры с мешалкой и с установкой для аэрации. С помощью едкого натрия устанавлинают значение рн 6,8 и при

-120 С стерилизуют. После охлаждения растворов н ферментеры приливают по 240 мл выращенных на посевной пи- тательной с еде культур штамма Ы иауйаяеь M-73 и подвергают аэрации с помощью я л воздуха/мин при 600 об. мешалки н 1 мин и выдерживают при

28 С. По истечении 17 и 24 ч после начала культивирования добавляют в ферментеры 0,4 % декстрина, 0,2% глицерина и 0,3 Ь дрожжевого экстракта и по истечении 30,41 48 и 50ч 0,4В декстрина, 0,2% глицерина и 0,4% дрожжевого экстракта в виде концентрированных смесей этих компонентов в объеме по 200 мл/добавку. Повьыение объема нследстние этих добавок коспенсируется испарением воды. Общее количество компонентов питательного раствора составляет 2,8 Ъ декстрина, 1,4 % глицеоина, 2,4 Ъ дрожжевого экстракта и 0,2% CaCO . По истечении 120 ч культивирование заканчивают.

2. Выделение антибиотика A

Полученную культуральную жидкость из пяти ферментерон (5x8 л) соединяют, добавляют 48 л ацетона, перемешивают при 25 С в течение 1 ч и затем центрифугируют. Прозрачный, освобожденный от мицелия нативный раствор сгущают до приблизительно 35 л в вакууме при 20-35 С едким натром, устанавливают значение рН 9 и экстрагируют с помощью 18 л этилацетата. Органическую фазу сушат с помощью 500 г сульфата натрия, в вакууме упаривают до 1 л и -добанляют 2 л циклогексана.

Отфильтровыванием выпаншего осадка получают после сушки на воздухе 12,5 г сырца антибиотика A.

3. Очистка антибиотика A а) 1,00 г сырого антибиотика разделяют на 20 пластинках из снликагеля (20х20 см} с использованием в качестве растворителя смеси хлороформа, метанола и 25%-ного водного раствора аммиака в отношении 40:6:1 (по объему). Изолируют главную зону с коэффициентом " - "0,34, Выход 327 мг антибиотика. б) 3,5 г сырого антибиотика подвергают ..роматографии на колонке длиной 100 см и диаметром 5 см, наколненной нейтральным силикагелем (силикагель 60, величина зерен ниже 0,063) 584800 и в качестве растворителя используют смесь хлороформа, метанола и 25 Ъ водного раствора аммиака в соотношении

40гб:11.

Улавливают абсорбирующую при 307 нм главную фракцию . Элюат упаривают в вакууме и остаток переосаждают из. этилового эфира уксусной кислоты / петролейного эфира. Антибиотик сушат в течение 4 дней при 100 С н высоком ва- )p кууме прн 0,01 терр. Выход 1,8 r антибиотика. в) 50 г сырого продукта подвергают распределению методом Крайга. в смеси растворителей из петролейного эфира, 15 уксусного эфира, диметилформамида и воды в соотношении 1,5:8,5:5:5 (по объему).

Проводят 80 приемов распределения, причем после шестидесятого приема Фракциониронанно отбирают верхнюю фазу ° Антибиотик находится в фракциях 21-68. Уланливаемуюеверхнюю фазу промывают водой, упаривают в вакууме и добавляют 100 мл этилового 25 эфира уксусной кислоты. Добавлением

1 л диэтилового эфира выделяют антибиотик, отфйльтровывают и н высоком вакууме сушат при 100 С и 0,01 торр в течение 4 дней. Выход 17 r антибио- 30 тика.

4. Выделение антибиотика В, Полученную согласно п.1 культуральную жидкость из пяти стеклянных ферментеров (5х8) соединяют, добан- 35 ляют 48 л ацетона, перемешивают при

25 С в течение 1 ч и затем центрифугируют. Прозрачный освобожденный от мицелия нативный раствор сгущают в вакууме при 20-35 С приблизительно 40 до 35 л, едким натром устанавливают значение рН 9 с помощью 18 л этил ацетата .экстрагируют. Органическую фазу выкидывают, значение 1 Н водного раствора после насыщения поваренной солью устанавливают 8,5 и дважды. экстрагируют с помощью 9 л этилацетата, Водную фазу выкидывают и органический раствор сгущают в вакууме до 1 л.

Из этого раствора выделяют сырой антибиотик с помощью 3 л нормального гексана. Осадок отсасывают, промывают небольшим количеством простого эфира и, размешивая, подают в воду, причем с помощью 10%-ного содого раство55 ра поддерживают значение рН 7,3. Лиофилизацией получают из этого раств >ра 10,5 г ;.ырого антибиотика В.

5. Очистка антибиотика В. а) 1,00 г сырого антибиотика В разделяют на 20 пластинок из силикагеля (20х20 см) с использонанием в качестве растворителя смеси хлороформа и метанола в соотношении 5:1. Изолируют проявляющуюся под УФ-лампой верхнюю зону.. Выход 344 мг антибиотика. . 65 б) 10 r сырого антибиотика растворяют в 600 мл бидистиллированной воды я подвергают фильтрации через находящийся в колонке длиной 70 см и диаметром 5 см ацетилиронанный поликапролактам. Уланливают абсорбирующие при

67 мн фракции. Главную фракцию экстрагируют хлороформом, хлороформенный раствор упаривают и остаток сушат в о течение 4 дней при 60 С и 0,01 торр.

Выход 5,2 г антибиотика. в) Полученный 1 г сырого антибиотика растворяют н 100 мл ацетона. Пентрифугируют и к раствору добавляют по порциям 17 мл циклогексана. Центрифугируют и осадок сушат в вакууме при

100 С и 0,01 торр. Выход 182 мг.

Таким образом найдено, что новые антибиотики можно получать. если штаммы ЛсИ орбяиеъ $Я- Q .t или N-73/И отдельно или совместно культивируют в питательной среде и антибиотик известными методами изолируют нз питательной среды.

Кроме того найдено, что новые антибиотики имеют сильное антимикробиологическое действие и наряду с тем имеют снойство ускорить или способствовать росту животных и улучшить использование корма животными °

Новый антибиотик А характеризуется следующими химическими и физическими свойствами °

Найдено, Ъ: С 56,19; Н 6,54;

О 37, 25; 4 ОСН 7,9.

С H я, 0>

Вычислено, В: С 56,40; Н 6,54;

О 37,05; 4 QCH 7,8.

+) по истечении 4 дней в высоком вакууме при 100 С, Точка плавления:

О

Начиная с приблизительно 142 С вещество подвержено легкому разложению, начиная с 177 С вЂ” сильному разложению. При скорости нагревания приблизительно 5 С/мин в области 196-205 С наблюдается процесс плавления. .Специфическое нращение:

fd)q -6,6 (с 1,0% в метаноле).

Молекулярный вес 570 — 1630.

Ультрафиолетовый спектр поглощения:

Я ь - 307 нм (с 0,0106% н метаноле ) (Е àþj>

Максимальные частоты поглощения в ИК-спектре (Квч): 2980, 2940, 2900, 1710, 1450, 1415, 945, 905, 870, 840, 820, 785, 50, 735, 700 см

Антибиотик А хорошо растворим в хлороформе, ацетоне, этиловом эфире уксусной кислоты, ацетонитриле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и низших спиртах, например метаноле, этаноле, менее растворим в воде, ди584800

Формула изобретения ;оставитель

Редактор JI. Новожилова Техред N.Êåëåìeø Корректор Н.Яцемирскщ о

Заказ 4628/721 Тираж 54 1 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, В-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, Ул. Проектная, 4 этнловом эфире, петролейном эфире и циклогексане.

Антибиотик A является аморфным бесцветным нейтральным веществом, которре при электрофореэе не мигрирует.

При сильном кислом гидролизе отщепляются различные восстанавливающие сахара (например, с помощью водной

10 вес.% серной кислоты 80 С). о

Коэффициенты pf антибиотика А íà Ið нейтральный пластинах с гелем крем- невой кислоты в различных растворителяхг °

Хлороформ:метанол — (90:1) 0,2?g

Хлороформ:метанол:25%-ный водный раствор аммиака (40s6rlO) 0,34;

Метанол 0,83;

Бутанолгледяная уксусная кислота." вода (брз20s20) 0,55.

Антибиотик Б может быть охарактеризован следующими свойствами

Элементарный состав С И О,Ф:

С 50,8; Н 7,2у О 42.

Молекулярный вес 1340-1390, Ультрафиолетовый спектр поглоще- 25 ния

Я. >< ** 265 нм (С 0,0091% в мета ноле).

1В >/сн) 265 нм 164. г Инфракрасный спектр поглощения 30

Максимальные частоты поглощения в ИК-спектре, КВчз 2960, 2920, 2850, 1630к 1445 1405к 1375 1200 985

940, 905, ?80, 750 см

Характерным для молекулы является чувствительность к кислотам. При значении рН 2 и комнатной температуре

18-22 С антибиотическая активность в течение 1 ч уменьшается до О.

Одновременно исчезает характерная полоса в УФ-спектре при 267 нм. Щелоками также антибиотик В разлагается.

Антибиотик В является нейтральным веществом, которое при электрофорезе не мигрирует. При киислом гидролизе (например, с помощью водной 10 вес. 4 серной кислоты при 80 С) отщепляются о восстанавливающие сахара.

Коэффициенты антибиотика В на пластинах с гелем кремниевой кислоты в различных растворителях: метанол:хлороформ (4:1)-0,49, н-бутанол."ледяная уксусная кислота:вода (60:20:20)-0,47.

Предлагаемые антибиотики эффективны против стафилококков, стрептококков, нейсерий, коринебактерий, микробактерий, сальмонелл, шигел, вибрионов, спорообразующих бацилл, клостридий, протея.

Предлагаемые антибиотики обладают незначительной токсичностью и могут быть применены в медицине и ветерена рии для лечения заболеваний, вызываемых перечисленными возбудителями, а также в качестве средства, способствующего росту животных.

Предложенные антибиотики новые и в научно-технической и патентной литературе не описаны.

Способ получения антибиотического комплекса, отличающийся тем, что штамм АейаорЪпеа Ы- 73 и/или I ))еИпор6зяеа M-?3 8 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 20-40 С и рН 6,0-8,0 пос4 ледующим выделением целевого продукта и разделением его на отдельные компоненты.