Способ получения фермента, окисляющего холестерин до перекиси водорода и холестенона

Способ получения фермента, окисляющего холестерин до перекиси водорода и холестенона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕеееУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 5848 Ql (61) До1толнительный к патенту— (22) Заявлено 170573 (21) 1934663/28-13 (23) Приоритет — (32) 170572

{51) И Клг

С 12 D 13/10

Гооудоретоенный иомитет

Сооото е1иннотроо СССР оо делам нзооретений н отнритий (31) Р 22 24131. 2 (33) ФРГ

P 22 241 33. 4 (43) Опубликовано 15.1277, Бюллетень №46 (53) УДК

615.779.94 (088.8) (45) Дата опубликования описания 10,0178

Иностранцы .

Вольфганг Грубер, Ханс Ульрих Берхмайер и Михаель Нельбек-Хохштеттер (Австрия) Клаус Бокан, Гюнтер Хольц, Иоханнао Грамзалль и Гюнтер Ланг (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма. Беринг Маннхайм ГмбХ (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА, ОКИСЛЯЮЩЕГО ХОЛЕСТЕРИН

ДО ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА И ХОЛЕСТЕНОНА

Изобретение относится к области микробиологии.

Способ получения фермента, окнсляющего холестерин до переки"и водорода и холестенона заключается в том, что 5 биомассу микроорганизмов-продуцентов экстрагируют буфером, содержащим неионогенное поверхностно-активное вещество и выделяют целевой прод,кт из бесклеточного экстракта, кроме того в ка- 10 честве продуцента используют культуру

Ргоесцпозлусеэ егу0лоеоЬв штамм КВС 9158. или АТСС 17895,или АТСС 42 77,или культуру )еосагсна Фогтвыв штамм АТСС 14811.

Микроорганизмы разлагают, раство- 16 ряют и извлекают с помощью буферного раствора, содержащего неионогенное поверхностно-активное средство.

Предпочитаеьыми неионогенными поверхностно-активными средствами явля- 3) ются алкиларилэтиленглн оли.и аддукты окисей полиэтилена и полипропилена, в особенност;. -их сложные эфиры. Принципиальная концентрация поверхностно-активного средства в используемом для 28 разложения (растворения) и для экстрагирования в буферном растворе зависит от применяемого поверхностно-активного средства и может определяться с помощью предварительных испытаний. При-80 годны концентрации 0,01-3%, преимущественно 0,1-1%. PH буферного раствора

5-9, предпочтительно 6-8.

Особенно хорошие результаты получаются, если микроорганизм перед растворением и перед экстракцией в присущ = ствии поверхностно-активного средства промывают смесью бутанола и воды.

Полученный экстракт, содержащий в растворе Фермент, очищают на нонообменнике.

В качестве нонообменника применяют анионообменные смолы, в особенности слабобазисные сорта, предпочтительными ионообменниками являются и те, которые несут диэтиламиноэтаноловую группу.

Вымывание ионообменника осуществля-. ют 0,01-0,2 М буферным раствором с рН 5-9. Концентрация поверхностно-активного средства, преимущественно 0,052Ъ.

Предпочтительно применение 0,030,1 М фосфатного буферного раствора с содержанием 0,2-0,7% поверхностноактивного неионогенного средства.

Из полученного таким путем элюата фермент осаждают с помощью солей или органических растворителей, например сульфата аммония, метанола и других.

584801,11ля повторного растворения,осажденного Фермента применяют.,буферный раствор, который содержит небольшое количество поверхностно-активного ,средствае 5

Фермент, полученный после иснссб)езннсго вымывания можно испольэовать непосредственно для количественного, определения хслестерина согласно уравнению колес ерин (HH) + Од+холестенсн+Н О

АктивноСть фермейта и эффективность . Предлагаемого СПОсОба определяют благодаря тому, что образующуюся фракцию

Н О замеряют по известным методам определения H q„

)6

Микроорганизмы ныращивают на среде йэ минеральных солей, содержащих пеплов, и как только достигают логарифМической фазы роста, добавляют водную эмульсию, которую, изготавливают путем мокрого размола водной суспензни холестерина и последующей стерилизацией при высокой температуре.

Таким ббразом удается достичь 100% использования холестерина н течение 25 односуточного выращивания культуры микроорганизма) прн выходе 1-2 г чисвзй субстанции сухих клеток. Вульон е культурой добавляют в таком количестве, что задают 1-20 г хслестерина 30

Ма каждый литр н период роста. Загрузку осуществляют порциями пс мере pocta микроорганизмов.

Небольшое количество холестерина добавляют в бульон с культ,урой еще н ;5 начале роста, т.е. перед достижением логарифмической Фазы роста.

В качестве питательной среды исполь зуют водный. раствор, содержащий, вес.Ъ:

О,1-2 пептона, 0,01--0,2 К,НРО,, 0,05- 46

1 Н4НеРО4, 0,05-1 гентагидрата сульфата магния, который содержит следы хлсрида железа и хлорида кальция, РН 6-9. Начальная загрузка холестернна составляет 0,01-0,1%.

Удельное содержание фермента дс

7 Р/г сухой массы бактерий и 1-3,5 r сухой массы бактерий на каждый литр питательной среды. удельное содержание микроорганизмов в ферменте удается увеличить благодаря тому, что микроорганизм сначала выращивают на ацетате и затем на холестерине в качестве единственного источника углерода.

Так, например прн выращивании.мик- @ роорганиэмов на среде иэ минеральных солей с укаэанным выше составом, нс при замене яептсна ацетатсм в количестве 0,5 вес.% до начала добавления хслестериноной эмульсии.дсстига- 69 ют повышения удельной активности дс

24 V/ã сухой массы, одновременно увеличивается содержание сухой массы до

6,5-г/л. Значительное повышение содержания сухой массы и активности до- бй

1 тигают благодаря тому, что к водной

Успенэии холестерина добавляют в ка- честне эмульгатсра небольшое количест.—

0 02 1 предпочтительно 0,05-0,3 вес.4 дрожжевого экстракта.

Предпочтительная питательная среда сОстОит из нОднОГО раствора р содержанием 0,1-2 вес.% ацетата (ацетата аммония), 0,01-0,2 вес.% КаНРО, 0,051 вес,.Ъ Н Н РО1, 0,05-0,1 вес.З сульфата магния в качестве гептагидрата, следов хлорида железа и хлорида кальция с величиной РН 6-9. При достижении логарифмической фазы роста ацетат заменяют хо.,естерином. Чтобы величина

РН в период выращивания останалась постоянной, непрерывно или порциями загружают кислоту. Во время фаэ роста с помощью ацетата н качестве источника углерода применяют уксусную кислоту, как только переходят на холестерин, уксусную кислоту заменяют минеральной кислотой. В этой второй стадии роста применяют соляную кислоту для регулирования величины pH » При этом достигают активность до 30 V /г сухой массы.

Н Р и м е Р 1- 2 л питательной среды, состоящей нз 0,5 вес.% казеинсного пептона, 0,05 нес.% K Pq,,, 0,2 вес. 5 Н, Н, РО„, 0,02 вес.В гептагидрата сульфата магния, следов хлсрида железа и хлорида кальция з водопроводной воде и с помощью KOH Регулируют велччину РН 7,5, зааевают в качающейся колбе с 200 мл хорошо выросшей предварительной культурй ррссс 1пс м сеь e Ъ с о3 з

ИВС 9158 и сильно нентилируют на магнитной мешалке. C началом логарифмической фазы роста, определяемой по возникающему увеличению помутнения, в период дальнейшего выращивания периодически загружают приготовленную с помощью мокрого размола, стерилизованную холестериновую,эмульсию, таким образои, что в течение 20 ч в колбу загружают

10 г холестерина. Через 5 ч после по" следней загрузки клеточную массу собирают путем центрифугирсвания. ПолуЧают 4 г сухой массы бактерий. После расщепления с помощью ультразвука получают 3 V /г фермента.

П Р и м е р 2. В сосуде культивируют 15л описанной в примере 1среды вместе с 0,5л хорошо выращенной предварительной культурой Р оас11пстпчсаз е Ийгоp9518 ATCC 1 7895 НрН сильной аэрации.С самого начала загружают 0,05% хслестерина.С началом логарифмического рос та непрерывно загружают стерилиэсвант ную холестериновую суспенэию в течение дальнейшего выращивания, так что в ферментер загружают в целом 50 г холестерина за 15 ч выращивания. При этом получают бактернальную массу в

40 г. Иэ бактериальной массы посред584801 ством расщепления (разложения) ультразвуком получают 7,1 V /г фермента.

Пример 3. Как описано в примере 2, в рабочем объеме 60 л культивируют бактерии Proaetinom es rgthpopotis (BC 9158). Приблизительно через 25 ч вводят свежую питательную среду в сосуд для выращивания бактерий и забирают раствор с выросшей культурой из этого сосуда.Одновременно в ферментатор вводят холестериновую суспензию; за 1 ч загружают около 3 r холестерина. Таким образом при непрерывном выращивании получают 1,2-1,5 r/ë бактериальной сухой массы с одинаковой удельной активностью.

Пример 4. В ферментаторе емкостью 20 л к 15 л питательной среды, состоящей иэ 0,5 вес.Ъ ацетата аммония, 0,05 вес.3 вторичного фосфата калия, 0,2 вес.В первичного фосфата аммония, 0,02 вес.Ъ гептагидрата сульфата магния и следон хлорида, железа и кальция в водопроводной воде, засеивают 0,5 л хорошо выращенной предварительной культуры бактерий Prooctinonuyes

erythmpolis ИВС 9158 и культивируют при

Ю сильной аэрации.

Величину РН культуры поддерживают постоянной посредством текущей загруз- ЗО ки 20%-ной уксусной кислоты до "концентрации биомассы около 1,5 г/л. После достижения этого содержания стерилиэованную суспензию непрерывно загружают в ходе дальнейшего выращивания таким Зя образом, что в целом н ферментатор эагружают 30 г холестерина в течение

20 ч выращивания культуры. Холестериновая суспензия содержит 0,1-0,23 дрожжевого экстракта. Затем для нейтрализации культуры вместо уксусной кислоты используют разбавленную соляную кислоту.

После завершения культивирования биомассу с помощью цеитрифугироваиия отделяют от раствора культуры.

П р и и е р 5. При двухступенчатом непрерывном способе выращивания комбинируют два ферментатора с рабочими объемами 15 л для первой и 70 л для второй ступени таким образом, что при часовом протоке 4 л, описанной в примере 1 питательной среды получается доля протока 0,25-0,30 для первой ступени и 0,055-0,065 для второй.

К началу культивирования вторую стуПень засевают хорошо ьыращенной предварительной культурой бактерий Рг ас-..

0ломусез егу1)пора11з . ATCC 17895 в количестве 1,5 л и вторую ступень засевают такой же предварительной культурой в количестве 0,5 л при сильной ; аэрации обеих ступеней, причем первую ступень нейтрализуют с помощью уксусной кислоты, а вторую ступень с по ющью соляной кислоты.

Одновременно во вторую ступень включают систему притока (4 л питательной среды/час). Величину РН выдерживают 7-7,5. .Таким образом за 1 ч получают 4 л бульона с культурой при

7 г/л при активности 30 /г сухой массы. Раствор культуры собирают в охлажденном резернуаре и бактериальную массу выделяют из него на непре рывно действующей центрифуге. Для регулирования виличины РН в первой ступени на каждый час требуется приблизительно 10 г 100%-ной уксусной кислоты.

FI р и м е р 6. 40 мл суспензии с бактериями ЯоааМ(а егу1ЬгороЬз (около 10 г сухой массы) примешивают к

40 мл h,--бутанола и в течение нескольких минут перемешивают при комнатной температуре. Смесь центрифугируют и из нее удаляют бутанол и лишнюю водную фазу. Осадок снова примешинают к 40 мл воды и после изготовления гомогенной суспенэии клеток снова при- . мешивают к 40 мл .и -бутанола, нескоЛько минут. перемешивают и.центрифугиру ют. Осадок суспендируют в 40 мл 0,01:И буферного раствора фосфата (РН 7,0}, к которому добавляют 0,3% неионогенного поверхностно-активного средства (алкиларилполизтиленгликоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем центрифугируют и осадок извлекают. Экстракт содержит около 120 ед. фермента с удельной активностью 3 ед/мл протеина.

Этот экстракт примешивают к твердому сульфату аммония до концентрации 1,3 И и сульфате аммония при температуре 0 С, затем суспензию центри- фугируют, осадок собирают на основе оченидной липофильной доли на поверх ности раствора. СпЕченный осадок фильтруют, рас"гноряют с 0,01 И буферного раствора фосфата, РН 7 и при температуре 0 С подвергают диализу по отношению к тому же буферному раствору, Диализированный раствор пропускают через уравнонешеннуа с помощью 0,01 М фосфатного буферного раствора колонну товарного анионита с диэтил аминозтаноловыми гр ппами на основе декстрана. При этом фермент адсорбируется. После промывки колонны с помощью того же буферного раствора про изводят последовательно промывку растворами с 0,5%, 2Ъ и 53 укаэанного вы1ше поверхностно-активного средства в воде. При этом вымываются большие количества загрязнений.

Затем последовательно осуществляют промывку с помощью 0,1 М фосфатного буферного раствора, РН вЂ” 7;

0,05 M фосфатного буферного Раствора, РН вЂ” 7, 0,2 N фосфатного буферного раствора, РН 7, и 0,5 М фосфатного буферного раствора РН 7.

584801

Формула изобретения

Составитель С, Малютина

Техред М.Левицкая Корректор Л.Небола

Редактор Н. Потапова

Заказ 4628/721 Тираж 541 Подписное

ЦИНИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул. Проектная, 4

Затем снова производят промывку с помощью 0,05 М фосфатного буферного раствора (рН 7) и фермент с 0,05 М фосфатного раствора, к которому добавляют 0,05% поверхностно-активного сред" 8 ства, вымывается.

В элюате находятся около 80% адсорбированной на колонне ферментной активности в ферменте с удельной активностью 25-30 Y /мг протеина.

Пример 7. Повторно осуществляют способ по примеру 6, но промывку водой с бутанолом не производят. Таким образом, получают экстракт для высаживания сульфата аммония, который содержит около 120 ед. фермента с удельной активностью в 1 ед/мл протеина. Дальнейшее обогащение известным способом приводит к получению продукта с удельной активностью 8-10 V /мг протеина.

Пример 8. повторяют способ по примеру 6, но вымывание анионита осуществляют с помощью водного раствора, который содержит 5% такого же поверхностно-активного средства в растворенном состоянии. Фермент поглощается из

@нионита (анионообменной смоле) .

1. Способ получения фермента, скисляющего холестерин до перекиси водорода и холестенона о т л и ч а ю щ н йс я тем, что биомассу микроорганизмовпродуцентов экстрагируют буфером, содержащим неионогеиное поверхностно-активное веще тво и выделяют целевой продукт из бесклеточного экстракта.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве проду-, цента используют культуру Proaetinan yоез erythropolia штамм КВС 9158, или

ARTCC 17895, или АТСС 4277, или культуру КосаМса formica штамм ATCC 14811,