Способ получения вирусных гемагглютининов
Патент 585847
Авторы
Классы МПК
Способ получения вирусных гемагглютининов
Иллюстрации
Реферат
1п1 585847
О0ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) 3 а явлено 24.12.75 (21) 2302679/28-13 с пргисоедииеиием заявки ¹ (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.12.77. Бюллетень № 48 (45) Дата опубликования описания 16.12.77 (51) М. К.,l. Л 61К, >7/16
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК 612.118.22/2 (088.8) (72) Авторы изобретения
О. В. Давыдов и А. В. Ефимов
Белорусский ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ГЕМАГГЛЮТИНИНОВ
Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии.
Известен способ получения парагриппозных гемагглютининов путем последовательной обработки вируссодержащей жидкости детергентом — сложным эфиром полиоксиэтиленгликоля, и дезинтегратором — этиловым эфиром, отделения водной фазы и удаления из нее остатков этилового эфира (1).
Однако известный способ является трудоемким и не обеспечивает полного освобождения скрытых гемагглютининов.
Целью изобретения является повышение выхода гемагч лютининов.
Это достигается тем, что используют простые эфиры полиоксиэтиленгликоля — смесь полиоксиэтиленгликолевых эфиров цетилстеаринового спирта в виде водного раствора или суспензии в этиловом эфире.
При этом для обработки вируссодержащей жидкости этиловый эфир берут в количестве
1/4 — 1/9 от объема вируссодержащей жидкости, Способ осуществляют следующим образом.
Берут емкость с виру ссодержащей жидкостью, последовательно добавляют туда простой полиоксиэтиленгликолевый эфир (например, смесь полиоксиэтиленгликолевых эфиров цетилстеаринового спирта — оксанол ЦС-21) в виде водного раствора и этиловый эфир или суспензию простого полиоксиэтиленгликолевого эфира в этиловом эфире. Конечная концентрация полиоксиэтиленгликолевого эфира в смеси составляет от 0,02 до 0,5 /с, объем вводимого этилового эфира — от 1/4 до 1/9 объема обрабатываемой вируссодсржащсй жидкости. Затем смесь встряхивают 15—
60 мин и центрифугируют 20 мин при 3000 об/ мин для разделения водной и эфирной фаз
10 смеси. Водную фазу отделяют от этилового эфира и оставляют ее для удаления остатков этилового эфира на 12 — 24 час при 4"C для парагриппозного вируса 2-го типа, вирусов гриппа и кори, а для других вирусов ир
15 «омиап ой температуре (18 — -20 С).
l1р и мер 1. 11олучсиие гсмаплютииииои парагриппозного вируса 3-го типа путем обработки вируссодержащей жидкости водным раствором смеси полиоксиэтилеигликолевых
20 эфиров цетилстеаринового спирта (оксаиол
ЦС-21) и этиловым эфиром.
К 4 мл жидкости, содержащей парагриппозный вирус 3-го типа (штамм У вЂ” 932) с геMàããëloòèHèðóþùèì титром 1: 4, добавля25 ют 0,08 мл 1%-ного водного раствора оксанола ЦС-21 (конечная концентрация оксанола
LIC-21 0,02 с/с ) . Пробиркi,. встряхивают в шуттель-аппарате 30 сек, добавляют 2 мл этилового эфира и продолжают встряхива30 ние в течение 45 мин, Затем пробирку цент585847
1О
3 рнфугйруют в течение 30 мни прп
3000 об/мип для разделения водной и эфирной фаз смеси. Отделяют водную фазу от эфирной и выдерживают ее при 18 С в течение 24 час для удаления остатков этилового эфира. Титр гсмагглютинипов в полученном таким способом препарате равен 1: 256, кратность прироста гемагглютинирующих титров в сравнении с исходным 64, что в 2 раза превышает выход гемагглютннннов по сравнению с известным способом.
Пример 2. Оптимальный вариант способа получения вирусных гемагглютининов с применением суспензин оксанола ЦС-21 в этиловом эфире (c одновременным введением детсргента и дезинтегратора).
К 4 мл жидкости, содержащей парагриппозный вирус 1-ro типа (штамм НЛ2-61) с гемагглютинирующим титром 1: 2, добавляют
1 мл 0,5 -ной суспензип оксанола ЦС-21 в этнлоиом эфире (конечная концентрация оксанола 0,1 /o, объем этилового эфира составляет 1/4 об ьсма обрабатываемой вируссодержащсй жидкости) . Смесь встряхивают
10 сек вручную и чб мин в шуттсль-аппарате.
Затем пробирку цснгрнфугируют 20 мин прн
3000 об/мин для разделения водной и эфирной фаз смеси. Водную фазу отделяют от эфирной и выдерживают ее прн 18 С в течение 20 час для удаления остатков этилового эфира. Титр гемагглютининов в полученном таким способом препарате равен 1: 2048, кратность прироста титров в сравнении с исходным 1024, что в 64 раза превышает выход гемагглютннинов по сравнению с известным способом.
ll ð и м е р 3. Оптимальный вариант способа получения гемагглютининов вируса группы Л путем обработки вируссодержащей аллантоисной жидкости суспензией оксанола LIC-21 на этиловом эфире (с одномоментным введением детергента и дезинтегратора).
Берут 8 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости (штамм вируса гриппа Л/Лнглия
42/72) с исходным титром гемагглютининов
1: 128. Добавляют 2 мл 0,1 /ц-ной суспензии оксанола ЦС-21 в этиловом эфире (конечная концентрация оксанола ЦС-21 в смеси 0,02"/ю, объем этилового эфира составляет 1/4 объема внруссодержащей аллантоисной жидкости) .
Смесь встряхивают вручную 10 сек и продолжают встряхивание в шуттель-аппарате
30 мин. Затем пробирку центрнфугируют в течение 20 мнн нри 3000 об/мин для разделения водной и эфирной фаз смеси. Отделяют водную фазу от эфирной. Пробирку с водной фазой закрывают ватной пробкой и помещают в холодильник (4 С) па 20 час для удаления остатков этилового эфира, а затем определяют титр гемагглютининов, который равен
1: 1024. Кратность прироста титров в сравнении с исходным равна 8.
Одновременно проводят обработку той же вируссодержащей аллантоисной жидкости известным способом, В этом случае титры
55 ьо
4 гемагглютипипов после обработки составляют менее 1: 2. Следовательно, в данном примере, известный способ це обладает демаскирующими свойствами в отношении гемагглютпнинов вируса гриппа Л, а, наоборот, инактивирует их.
Пример 4. Получение гемагглютинина вируса кори путем обработки коревого диагностикума суспензией оксанола ЦС-21 на этиловом эфире (с одновременным введением детергента и дезинтегратора).
Берут 18 мл коревого,диагностикума с исходным титром гемагглютининов 1: 2. Добавляют 2 мл 0,2 /ц-ной суспензии оксанола LIC21 в этиловом эфире (конечная концентрация оксанола ЦС-21 в смеси с коревым диагностикумом равна 0,02 /ц, обьем этилового эфира составляет 1/9 объема внруссодержащей обрабатываемой жидкости). Смесь встряхивают для псрсмешнвания жидкостей в течение
10 сск и продолжают встряхивание в сосуде, помещенном в лед, в течение 15 мин. Затем пробирку цснтрифугнруют в течение 20 мин при 3000 об/мин для разделения водной и эфирной фаз смеси. Отделяют водную фазу от эфирной. Сосуд с водной фазой помещают в холодильник прн 4 С на 12 час для удаления остатков этилового эфира, а затем определяют титр гемагглютининов. Титр гемагглютининов равен 1: 8. Кратность прироста титров РГЛ в сравнении с исходным равна 4, что не менее эффективно, чем по известному способу (по Norr by Е. Proc, Soc. Ехр11. Biol.
Med., 1962, 111, 3, с. 814 — 818).
П р и мер 5. Получение гемагглютинина парагриппозного вируса 2-ro типа путем обработки вируссодержащей жидкости суспензией оксанола ЦС-21 на этиловом эфире и дополнительным введением этилового эфира на втором этапе.
Матрас с культуральной жидкостью, содержащей парагриппозный вирус 2-го типа (штамм ПГ2-V>-931), подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию при минус 21 — 18 С. Определяют исходный титр гемагглютинипов. Они имеются только в цельной исходной вируссодержащей жидкости. В пробирку переносят 4 мл вируссодержащей жидкости и добавляют 1 мл 0,375 /ц-ной суспенции оксанола LIC-21 в этиловом эфире (конечная концентрация оксанола ЦС-21 в смеси с вируссодержащей жидкостью 0,075 / ) .
Смесь встряхивают для перемешивания жидкостей в течение 10 сек, добавляют 1 мл этилового эфира и продолжают встряхивание в шуттсль-аппарате в течение 30 мин при
3000 oo/ìèí для разделения водной и эфирной фаз смеси. Отделяют водную фазу от эфирной и выдерживают ее при 4 С в течение
24 час для удаления остатков этилового эфира. Определяют титр гемагглютининов вируссодержащей жидкости. Титр гемагглютининов равен 64. Кратность прироста титра гемагглютининов в сравнении с исходным равна
585847
Формула изобретения
Составитель Г. Смирнова
Редактор М. Дмитриева Техред Л. Гладкова Корректоры: Н. Федорова и Л. Орлова
Подписное
Зака", 2712/10 Изд. 1 /е 990 Тираж 693
НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
64, что в 4 раза превышает выход гемагглютининов по сравнению с известным способом.
1. Способ получения вирусных гемагглютининов путем обработки вируссодержащей жидкости детергентом и этиловым эфиром, отделения водной фазы и удаления остатков этилового эфира, отлич ающи и ся тем, что, с целью повышения выхода гемагглютининов, в качестве детергента используют смесь полиоксиэтиленгликолевых эфиров цетилстеаринового спирта.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для обработки вируссодержащей жидкости этиловый эфир берут в количестве 1/4—
1/9 от объема вируссодержащей жидкости, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Вопросы производства вакцин и сывороток, т. 2, Киев, 1968, с. 11 — 13.