Способ получения пепстатинов

Способ получения пепстатинов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскии

Социалистииескии

Реснубпик (11) 588927 (61) Дополнительный к патенту (22) ЗаявлЕно»03. (21) 1762234/13

С 12 D 13/06 (23) Приоритет (32) 26 . 0 3 . 71 (31) 17292/71 (33) Япония (43) Опубликовано 150178 Бюллетень № 2 (45) Дата опубликования описания 150178

Государственный иамитет

Совета Министров СССР оо делам изооретений н открытий (53) У fl К 615. 45: 615.

179. 931 (088. 8) Иностранцы

Хамао Юмезава, Тецуи Мияно, Кохтаро Фунайси, Томно Такеюти н Такааки Аеаги (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Зейдан Ходзи Бисейбицу Кагаку Кенкуй Кай (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПСТАТИНОВ

2 снятое молоко и/или соевую муку в качестве источника азота и инкубируют

3-10 дней в обычных аэробных условиях до достижения культурой максимальной антипепсинной активности. Активное вещество экстрагируют и- -бутанолом из культуральноф жидкости или ее фильтрата или-метанолом из мицелиальной массы. Полученйый экстракт концентрируют до сиропа или желтого осадка. Затем сироп вливают по каплям в 5-20 объемов воды для получения осадка и осадок отфильтровывают. Осадок высушивают и получают неочищенные новые пепстатины. Неочищенный пепстатин раст. воряют в низших спиртах и этерифицируют путем нагревания или выдержки в течение нескольких часов при комнатной или повышенной температуре с небольшим количествоМ катализатора этерификации, например с соляной или серной кислотой, 5- -толуолсульфокислотой, хлористым тионилом, пятихлористым фосФором йли хлорокисью фосфора.Получаемяй при этерификации метиловый эфир неочищенного пепстатина является смесью и большую часть метилового эфира пепстатина выкрщ;таллизовывают из метанола. С поме4ью тонкослойной хроматографии ))ыбо найдено, что метиловые

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения лекарственного препарата,который может быть использован при лечении язвы желудка. Известен способ получения пепстатинов, заключающийся в том, что штаммы Stveptomsces testacens

АТСС 921469 или -.— St e p t o m s ce s ag ге ntco(.us со".tovonocensis ATCC 921468 выращивают в аэробных условиях на пнтатель- 10 ной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли,с .последующим выделением целевого продукта зкстракцией н -бутанолом культуральной жидкости и дальнейшей очисткой (1) . 15

Однако известный способ не обеспечивает получения пепстатинов B и С.

ДлМ получения пепстатинов В и С по предлагаемому способу в качестве источников азота используют казеин, сня-,щ тое молоко и/или соевую муку, целевой продукт экстрагируют и этерифицируют низшим спиртом и отделяют.в виде низшего алкилового эфира.

Пепстатины: получают посредством 25 выращивания пепстатинобразующих штам- мов St eptomsces testaceous АТСС (е 21469 или St t eaton ces а ен1эоСцв маг.towonocensis ATCC )и 21468 на питательной среде, содержащей казеин, 30

I

=----:- -4. (51) M. Кл.

588927 эфиры пепстатина и новые пепстатины содержатся в отноШении 1:1. Пепстатины В и С перекристаллизовывают из метанола и выпавшие кристаллы отфильтровывают. Маточный раствор почти не 5 содержит метилового эфира пепстатина и новые пепстатины выкристаллизовывают из этого маточного раствора в виде тонких игл, Щелочные соли новых пепстатинов, )O например полученный в виде натриевой соли пепстатин В, представляет собой белый аморфный порошок, который плавится с разложением при 250-255 С, обнаруживает ингибирование пепсина (.L0s ) при 0,05 1 . Он в 10 раз луч-. ше (300 мг/мл) растворяется в метаноле, чем исходный. Он растворим в водном бутаноле, этаноле,,изопропиловом спирте, диметилформамнде, диметилсуль-$) фоксиде, уксусной кислоте, пиридине, слегка растворим в водном ацетоне, трудно растворим в безводном ацетоне безводном бутаноле, хлороформе, бензоле. эфире и воде. . 25

Пример 1. Штаммом Ы гвр1от qes testa< ens,o0ðàçóèùèì пепстатин заражают стерильную среду, состава, вес.Ъ!

Глюкоза 5,5 30

Соевое масло 2

Снятое молоко 4,5

Казеин 5

К н о 0,15

NICE 0 35 35

% 50, .7И 0 0с 15 (Рн 6,45) в 2900 л объема и инкубируют 112 ч при 23-24 С при аэрации и перемешивании. Культуральная жидкость содержит антипепсинное вещество, эквивалентное 40

2260 Д мл пепстатина. При помощи разбавленной серной кислоты рН жидкости доводят до 2,5 и добавляют 3600 л метанола. Затем жидкость геремешивают

40 мин при температуре 15-20 С, добавляют 4% вспомогательного порошка для фильтрования, отфильтровывают и промывают. При помощи щелочи рН доводят до 10, метанол испаряют в вакууме и получают 1900 л водного достатка.

К этому остатку добавляют 800 л н -бутанола и рН смеси доводят до 7,0.

После перемешивания в течение 30 мин при 20 С отделяют 960 л" бутанольного экстракта. Затем рН бутанольного экстракта доводят до 3,0 и концентрированием в вакууме получают 55 л концентрированного сиропа..Этот сироп по каплям и при перемешивании добавляют в течение 60 мин в 800 л воды и образующийся осадок отфильтровывают.. 60

Осадок промывают водой,лйофилизируют и получают 7990 г желтого, неочищенного порошка новых пепстатинов. Антипепсинное вещество, эквивалентное пепстатину, составляло 644 порошка, 66

6080 r полученного неочищенного порошка растворяют в 33 л метанола и для обесцвечивания добавляют 1,25 кг активированного угля. К 38 л этого обесцвеченного метанольного раствора добавляют 125 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают 2,5 ч о при 60 С. Реакционную смесь нейтрализуют добавлением 0,63 л триэтиламина, перемешивают 120 мин при 50-60 С и получают кристаллический порошок. После промывки и сушки этого порошка в вакууме получают 3230 г метиловых эфиров нового пепстатина, имеющего антипепсинную активность ((1) ) при

0,056 4 . Он плавится с разложением при 250 251 С, f

Пример 2. 3100 г нового метилового эфира пепстатина, полученного в примере 1, растворяют в 130 л

2 н. Na0H 90% метанола при 60 С и омыляют 2 ч. Реакционную смесь концентрируют в вакууме для испарения метанола и получают грязевидный концентрат. Концентрат растворяют в 20мл воды, насыщенной н -бутанолом, добавляют 15 л воды и с помощью разбавленной фурфуриловой кислоты рН доводят до 3,0. После 20-минутного перемешивания, 18 л верхнего бутанольного слоя по каплям выливают в 270 л воды.

Образовавшийся осадок после 60-минутНого перемешивания отфильтровывают и промывают водой. Промытый осадок высушивают в вакууме и получают 2500 r ,белого порошка. Этот порошок плав0ится с разложением при 205-210 С и(А) .-84

D (С м 1,0 — метанол) . LD> (50%) ингибитирование по отношенйю к пепсину было 0,055 "f . Согласно кривой титрования на 700 мг порошка расходовалось 9,7 мл

О, 1 н. No(OH.

Пример 3. 100 г метиловых эфиров нового пепстатина, полученного в примере 1, растворяют в 4 л абсолютного метанола и обесцвечивают 20 г активированного угля. Метанольный раствор оставляют стоять на ночь и получают сперва 24 r белых кристаллов.

4,2 л метанольного маточного раствора концентрируют до 1,3 л и осаждают.

Этот осадок кристаллизуют после 60 мин перемешивания цри 60 С. Повторная кри4 сталлизаци я через 12 ч дает еще 5, 5 r вторичных белых кристаллов. Эти кристаллы растворяют в 1,5 r горячего метанола и обрабатывают активированным углем. Метанольный раствор оставляют стсять на ночь и получают еще 12,0 г белых кристаллов.

Указанные кристаллы имеют следующие физико-химические свойства.

588927

Пример . 4. Штаммом, образующим пепстатин,. заражают 130 л стерильной среды состава, вес.%:

1люкоэа 6,0

Глицерин 2,0

Снятое молоко 4

Молочный каэеин 4,5 (Н Р04

0 1 и се 0,3 45

bAg 504 7 Н 0 0,1 (рН 6,8) и инкубируют как в примере 1. К

125 л культуральной жидкости, оодержащей антипецсинное вещество в колиt честве, эквивалентном 170 гпепстатина 50 добавляют 60 л и -бутанола и перемешивают 40 мин при комнатной температуре.- После этого бутаиольный, водный и твердый слои (мицеляльная масса) разделяют центрифугированием.

Бутанольный слой промывают водой и концентрируют в вакууме до.1,5 л сиропа. рН сиропа доводят до 3,0, до- бавляют 7,5 л н -гексана и при перемешивании получают желтовато-коричневый осадок. После 60-минутного пе60 ремешивания осадок: отфкльтровывают, прозаявают и высушивают в вакууме и получают 164,г нового неочищенного пепстатииа, имеющего антипепсинную активность LD = 0,075 )" . 65

Кристаллы после первой кристаллизации: т. пл. 250-251 С (раэложение), (д.1 = -90,5 С (С 0,5, уксусная кислога), LD = 0,05$ а

Вещество и О, 35: Вещество И О, 39

1:1-1:2 (хроматография в тонком слое хлороформ: метанол: уксусная кислога»

94:4:1) .

Кристаллы после второй кристалли- 10 эации:

r.ïë. 253-254 С (разложение ), C r 2О о .) = -91,5 ((С 0,5, уксусная кислота), LD „ = Oi05.

Эти крйсталлы главным образом со- 15 держат вещество с R 0,35 и следы вещества с R< 0,42 (хроматография в тонком слое, хлороформгметанол."уксусная кислота = 95:4:1) .

Кристаллы после третьей кристаллизации: т.пл„ 254-255 C (разложение), faLI * -95,5 С (С = 0,5 уксусная кислота) (.D =0,05 7 .

Эти кристаллы содержат главным образом вещество М 0,39 (пепстатин

В) и следы вещества, имеющего К 0,42. (хроматография в тонком слое, хлороформ:метанол:уксусная кислота =95:4:1).

Найдено, %: С 60,14; Н 9,38; 9,74.

Полученные вещества умеренно раст30 воримы в диметилсульфоксиде,диметилформамиде и уксусной кислоте, трудно растворимы в метаноле (5-10 мг/мл), но более растворимы, чем метиловый эфир пепстатина.

150 г нового пепстагина растворяют в 1,5 л 90%-ного метанола при 40 С и обесцвечивают 150 r акгивированного угля.К 1,6 г обесцвеченного метаноль" ного раствора добавляют 1,0 л воды при комнатной температуре и получают студенистый осадок. Осадок отфильтровывают, промывают 50%-ным метанолом, лиофилиэируют и получают 94 г слегка желтоватого порошка ° Его ).1) по отношению к пепсину 0,062 ) Этот порошок растворяют в 90%-ном метаноле, дважды обрабатывают активированным углем и получают 15 г порошка нового пепстатина. Его И 0,055 7, точка разложения 198-205 С и IaL)D = -79 С (С,О метанол). При хроматографии в тонком .слое он имеет R < 0,35 (пепстатин)

0,39 (пепстатин В и пепстатин С) и R 0,42.

Пример 5. Штаммом, образующим пепстатин, заражают 130 л стерильной среды состава, вес.%:

Глюкоза 6,0

Глицерин 2 0

Снятое молоко 1,5

Казвин 1Р5

Соевая мука 5,7

К,HPO 0, 1

Ма СС 0,3 иlAg60, 7Н 0 . 0,1 (рН 5,5) и инкубируют,. как в примере 1.

110 л культуральной жидкости, содержащей антипепсинное вещество в количестве, эквивалентном 132 г пепстатина, отфильтровывают с добавлением

7 кг вспомогательного средства для фильтрования; с помощью разбавленной серной кислоты рН доводят до 2,0 и отделяют 33 кг мицеляльного остатка и

75 л фильтрата. К Мицеляльному осгатку добавляют 82 л абсолютного метанола и получают взвесь, которую переме- шивают 40 мин...После этого взвесь отфильтровывают и остаток дважды прогрызают 40 л 70%ного метанола и-получают 140 л водного метанольного элюата. К этому фильтрату добавляют 35 л Н -бутанола и после 15-минутного перемешивания отделяют 37 л бутанольного слоя от 73 л водного слоя. 140 л вышеуказанного водного метанольного элюата, полученного.из мицеляльного осадка концен" ,трируют в вакууме до 37 л водного раствора и смешивают с 37 л бутанольного экстракта, полученного из фильтрата культуральной жидкости. Эту смесь центрифугируют для удаления водного слоя и получают 35 л бутанольного экстракта. После доведения рН бутанольного экстракта до 3,0 его концентрируют в вакууме до 1 л сиропа. Этот сироп по каплям добавляют в 15 л в ды, перемешивают и получают осадок. Осадок отфильтровывают, .промывают водой, 588927

3l l

Пример 7. Новый пепстатин в свободной кислотной форме (4 г) и лученный в примере 2, растворяют в

3 00 мл абсолютного этанола при нагре«бб высушивают при 60-70 С и получают 153 г желтоватого поро»»»ка нового непстатина, имеющего антипепсинну»о активность LD

5О

0,072 g. Полученный перо»»»ок этерифицируют метанолом, как описано в примере 1, и получают 62 r белого кристаллического порошка метилового эфира нового епстатина. Его Ь33 = 0,05 p точка разложения 250-352 С и ».с») -90,6 (С 0,5, уксусная кислота). С помо- 3(. щью хроматографии в тонком слое устанавливают, что он содержит главным образом метиловый эфир нового пепстатина (й 0,39) и следы метилового эфира пепстатина. 15

30 г полученного метилового эфира нового пепстатина омыляют в 450 мл раствора 0,2 н. Йс»ОН в 90Ъ-ном метаноле в течение 2 ч при 60 С. С помощью разбавленной "С рИ реакционной 20 смеси доводят до 3,5 и смесь концентрируют до 150 мл с образованием осадка. Осадок отфильтровывают,промывают метанолом, высушивают в вакууме и получают белый порошок (17,9 г) натрие,вой соли нового пепстатина, .имеющий

LD, 0,05 У, т.пл. 245-249 С (разложение) и Гд.»23 = †(C = 1,0 метанол).

При его титровании на 700 мг расходуется 10,1 мл 0,1 н.ПО °

Пример б . Штаны»ом, образующим пепстатин, заражают 130 л стерильной среды состава, вес.Ъ:

1"люкоза 6,0

1 л»»церин 3,0

Молочный казеин 4,2

Пептон 1,0

К2нр04 0,1

NAACP. 0,30

tAg 504 7 Н. О (рН 7,0) 1 и йнкубирование проводят 132, 5 ч

40 в условиях, указанных в примере 1.130л культуральной жидкости, содержащей антипепсинное вещество в коли »естве, эквивалентном 111 r»»е»»стат» на, обрабатывают так же, как в примере 3., и полу-5 чают 132 г неочищенного нового пепстатина имеющего (- »3 — О по о" " е»ошению к пепсину О, О 76 f.

Полученный таким образом желтый порошок обрабатывают, как аписа»ло в примере 1, и получают 53,5 г метилового эфира нового пе»»статина., имеющего 133 0,051 g, точку разложения

255-256 С и t.d.je = -95,5О (С - 0,5с уксусная кислота). С помощью хромато- 85 графин и тонком слое определяют.33

0,35 и Я 0,39 (1: 1), но 3 (Ä. 0,42 1 отсутствует. Полученный таким .обраХ зом пепстатиновый препарат содержит равное количество нового пепстатина 60 (1:1). вании и добавляют 2 мл концентрированной Н 504 Эту смесь нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане 6 ч и концентрируют в вакууме до 50 мл. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают этанолом, высушивают и получают 16 r порошка.

Порошок перекристаллизонывают из абсолютного этанола (100 мл) и получают

1,15 г белого кристаллического порошка этилового эфира нового пепстатина (этиловый эфир пепстатина B) имеющего

= 0,052 3, точку разложения 250251 С и (А) = -90 (С = 0,5, уксусная кислота).

Пример 8. 3,0 г нового пепстат»лна, полученного в примере 2, растворяют в 100 мл абсолютного и -пропилового спирта при нагревании, добавляют 0,2 мл концентрированной серной кислоты и этерифицируют 6 ч при 80 С.

Реакционную смесь концентрируют в вакууме до 20 мл с образование осадка.

Осадок отфильтровывают, промывают

»h -пропиловым спиртом, высушивают и получают 900 мг белого порошка. Этот порошок перекристаллизовывают из 40мл абсолютного пропилового спирта и получают 480 мг белого порошка (3» -пропиловый эфир пепстатина В). Он имеет

0,073 3 т.пл. 218-220 С (разложение) и td ) " = -89,5 (C "- 0,5, уксусная кислота3) .

Пример 9. 3,0 r пепстатина, полученного в примере 1, растворяют в 100 мп теплого абсолютного н -бутанола и добавляют 0,2 ».»»» концентри- рованной серной кислоты. Этерификация продолжается б ч при 80 С, раствор концентрируют в вакууме до 2 мл с образованием осадка. Осадок отфильтровывают, про»ывают, »» -бутанолом, высушивают и получают 800 мг белого порошка. Порошок перекристаллизовывают из н -бутанола и получают 340 мг белого порошка (4» -бутиловый эфир нового пенстатина В), имеющего »335О=

0,084 7», т.пл. 205-207 C (разложение) и fCh) = -88 (C 0,5, уксусная кислота) .

Формула изобретения

Способ получения пепстатинов путем, выращивания штамма .Stvepto m w cез te sta cen s . ATCC 921469 или Mreðtîãî÷ceç аЕ3 vente6l .us маг. tesor»ocer»sos ATCC

921468 на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли с последую»»»иМ выделением целевого продукта,о т sf и ч а юшийся тем, что, с целью получе ния пепстатинов В и С, в качестве источников азота используют казеин, сня588927

Составитель С.Малютина

Р акто Л.Емельянова Техред А.Богдан Корректор С.Ямалова

Заказ 195/721 Тира:к 568 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Иинистров СССР по делам иэобретений и открытий

113035 Иосква й-35 Ра ская наб. . 4 5

Филиал ППП Патент, г. Умгород, Ул. Проектная, 4 тое молоко и/или соевую муку, целевой продукт экстрагируют и этерифицируют низшим спиртом и отделяют в виде низшего алкилового эфира.

Источники информации, принятые so внимание при экспертиэе:

1. Уоогnat Antibiotics 923, 5, р.259, 263.