Холерный бактериофаг 7106 для проготовления диагностических препаратов

Холерный бактериофаг 7106 для проготовления диагностических препаратов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

АНИЕ

ОПИС

Союз Советских

Социалистических

Республик (11р 5 892 54

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) ЗаЯвлено12Р4.76 (21) 2338654/28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет— (43) Опубликовано 25,0178. Беоллетень № 3 (45) Дата опубликования описания 1601.78 (51) М. Кл.

С 12 К 7/00 е оирдарвтееиныи иомитет

Совета ееиииатрео СССР ио иолам иеооретеиий и атирктий (53) УДК 576.858»9 (088.8) (72) Авторы иэобрйт ния м с. Дрожевкина, и. к. Александрова и (0. и. Арутюн в

pl) заявитель ростовский-на-дону государственный научноисследовательский противочумный институт (54) ХОЛЕРНЫЙ БАКТЕРИОФАГ 7106 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ

ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к медицине.

Известен холерный бактериофаг В иэ колленции Ашешкова (1). Он обладает относительно узким диапазоном действия и проявляет активность в основном на 5 холерные вибрионы классического биотипа.

Новый холерный бактериофаг 7}06, обладает высокой специфичностью и отличается от холерного бактериофага В 10 широким диапазоном литической активнос.ти по отношению к холерным вибрионам

Эль Тор.

Холерный бактериофаг 7106 вЫделен )5 в 1970 r sa испражнений виброносителя (возбудитель холеры Эль Тор). В результате последовательной селекции прозрачных негативных колоний на плотной среде в сочетании с мульгенным дей- 20 ствием УФ-лучей и пассажами в изолированной петле тонкого кишечника морской свинки получен стабильный.вирулентный бактериофаг 7106.

Холерный бактериофаг 7106 для при- 26 готовления диагностических препаратов хранится в коллекции Ростовского-наДону государственного научно-исследова- тельского противочумного института под номером 7106 и характеризуется сле- @»

2 дующими морфологическими и физиологическими признаками.

Морфологические признаки ° Бактериофаг имеет многогранную головку, в про» екции гексагональной формы, размером

500 30х450 30А и отросток с сокращающимся чехлом длино 1010 30 А и шириной 137+15 А. По морфологии частицы фаг 7106 относится к,y группе, согласно классификации A. С. Тихоненко.

ФизиолоГичесние Итризнаки. Формирование негативных колоний. Двухслойный агар Мартена (рН 7,6), приготовленный по методу Грациа с индикаторной культурой вибриона Эль Тор штамм 75 М. Через 18 24 час инкубации при 37 C колонии фага прозрачные, правильной округлой формы с четко контурированным ровным краем, диаметром 0,5-1,5 мм.

Серологические свойства. Относится к Y серологическому типу холерных фагов по отечественной "классификации.

Антигенные свойства. При введении кроликам вызывает выработку специфицеских антител против фагов типа:, Антигенные свойства бактериофага 7106 стабильны. Титр сыворотки 1:250, эа

5 мин нейтрализует 1004 корпускул мологического фага. Титр бактриофага

7106 по Грациа ъ 10, по Аппельману

589254

10". Продуцентами бактериофага являются специально подобранные нелизогенные штаммы нибрионов Эль Тор. Оптимальная множественность инфекции

0 05-0,5. Продолжительность одиночноgo цикла развития 24 мин. Урожай—

60 корпускул на одцу микробную клет- ку. ,Специфичность ° Строго специфичен.

Не лизирует микробов других видон.

Диапазон литической активности в пределах гомологичного вида микробов.

Бактериофаг обладает широким диапазоном атитического действия на вибрионы

Эль Т©р. По диапазону литической активности превосходит известный бактериофаг В.

Полезность изобретений заключается в том, что с помощью бактериофага 7106 осуществляется приготовление новых

Фаговых препаратов для диагностики и

Идентификации возбудителя современной холеры Эль Тор.

П р и м е.р 1. Для приготовления диагностического холерного фага;ис- 25 пользуют фаг 7106 в виде монофага. Для этого фаг 7106 в количестве 4 мл вносят во флакон с 200 мл бульона Мартена (рН 7,6) и одновременно добавляют

2 мл 3-часовой бульонной культуры хо- 30 лерных вибрионов биотипа Эль Тор штамм

75 М. Через 3 час инкубации при 37оС содержимое флакона фильтруют через фильтр Зейтца с асбестовой стерилизующей пластиной для освобождения от мик-З5 робных клеток. Приготовленный препарат фага 7106 (фильтрат) проверяют на специфическую и неспецифическую стерильность и активность известными методами. Определяют титр фага методом агаровых слоев по Грациа. Для этого в растопленный, остуженный до 45 С > и разлитый по пробиркам полужидкий агар вносят 0,2 мл 3-часовой бульо.;ной культуры чувствительного штамма холерных вибрионон. В эту смесь вносят 1 мл Фага в разведениях 10 и 10>. Содержимое пробирки перемешивают и выливают на поверхность 1,5 агара в чашке Петри.

После застывания агара чашки помещают в термостат при 37 С и через 12- @

18 час учитывают количество негативных колоний фага. Титр диагностического фага должен быть не ниже и 106.

Полученный таким способом диагностический фаг 7106 используют для быстрого определения холерных вибрионов. Холерный диагностический фаг используют неразведенный. Для этого пастеровской пипеткой или платиновой петлей (диаметром 5 мм) наносят каплю @ цельного Фага 7106 на газон, приготовленный днухслойным методом иэ 3-часовой культуры испытуемого подозрительного на холерные вибрионы штамма. Через 6-12 час инкубации при 37 С произ» 65 водят учет результатов по следующей схеме:

++++ — полный лизис культуры на месте нанесения фага;

+++ — хорошо выраженный лизис и слабый вторичный рост;

++ — отчетливый ливис с более обильным вторичным ростом или единичные негативные колонии;

+ — слабые следы лиэиса и обильный вторичный рост на месте нанесения фага; — вЂ,следов ливиса культуры нет °

Положительным считается лизис культуры на ++++, +++ и ++. Исследуемая культура не может быть признана холерной при результатах оцениваемых на + и †. Использование диагностического монофага 7106 для определения вида 480 штаммов вибрионов Эль Тор, выделенных в различных очагах холеры, позволило быстро в течение 6-12 час определить принадлежность к холерным вибрионам 474 штаммов иэ 480 исследованных (98,7%).

Использование применяющегося для этой цели фага Эль Тор позволило правильно диагносцировать только 415 штаммов (86,4%) .

П р е р 2. Способ исполЬзования фага 7106.для получения антифаговой сыворотки.

Приготовление антигена-фага для иммунизации животных производится следующим образом: Фаг 7106 в количестве 4 мл вносят во флакон с 200 мл бульона Мартена (рН 7,6) и одновременно добавляют 2 мл 3-часовой бульонной культуры холерных вибрионов Эль

Тор штамм 75 М. Через 3 час инкубации при 37 С содержимое флакона фильтруют через фильтр Зейтца с асбестовой стерилиэующей пластиной для освобождения от микробных клеток. Приготовленный фаг 7106 (фильтрат) проверяют на специфическую и неспецифическую стерильность известными методами и определяют его титр. В качестве антигена используют фаг с титром п 10 .

Для иммунизации используют взрослых кроликов весом 2,5-3 кг. Фаг вводят стерильно шприцем в краевую вену уха кролика. Иммунизацию кроликов производят тремя циклами по четыре инъекции фага в каждом цикле. Фаг 7106 вводят н следующем количестве:

1 инъекция 2 мл Фага

2 инъекция 4 мл фага

3 инъекция б мл фага

4 инъекция 8 мл фага.

Интервал между инъекциями 4-5 дней, между циклами 10-14 дней. Через 14 дней после последней инъекции фага н третьем цикле производят тотальное обескронливание кролика путем взятия стерильно (шприцем) крови из серца.

После отстаивания и свертывания форменных элементов крови при помощи стерильной пипетки отсасывают сыворот589254

Составитель Н.. Бондаренко Техред N.Êåëåìåø

Корректор С. Ямалова

Редактор A. Бер

Заказ 340/18 Тираж 568 Подписное

ПНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ку крови и разливают ее по ампулам в стерильных условиях. Способность антифаговой сыворотки подавлять литическую активность фагов /типа устанавливают путем определения ее титра по методу Адамса 91961). Для этого антифаговую сыворотку разводят последовательно двухкратными размедениями в бульоне Мартена (рН 7,6) начиная с разведения 1:25; 1:50 и т.д. фаг 7106 разводят в бульоне так, чтобы в 1 мл содержалось п 10" корпускул. 0,9 мл каждого разведения сыворотки подогревают в термостате при 37эС, после чего смешивают с 0,1 мл фага: смесь (г сыворотки и фага выдерживают при 37 С с в течение 5 мин. Из этой смеси переНосНТ 0,1 мл в 9,9 MJI холодного бульо на, тщательно перемешивают и 0,1 мл этого разведения вносят в 3,5-4 мл полужидкого агара (0,5-0,7%), расплавленного и остуженного до 45 С, куда добавляют 0,2 мл 3-часовой бульонной культуры индикаторного штамма вибриона Эль -Тор 75 М. Тщательно пе(емеши25 вают и выливают вторым слоем на поверхность плотного (1,5-2%) arapa в чашку Петри. Одновременно все манипуляции производят с контролем, где вместо антифаговой сыворотки применя30 ют физиологический раствор. Через

18-24 час инкубации при 37ОС подсчитывают количество негативных колоний на опытных и контрольном посевах.

На основании этих данных составляют уравнение и вычисляют процент нейтрализации фага. При этом количество негативных колоний фага в контроле принимается за 100%. Предельное разведение сыворотки, которое полностью нейтрализует гомологический фаг, при- 40 нимается за титр антифаговой сыворотки. Полученная таким способом антифаговая сыворотка используется для определения /типа холерных фагов среди свежевыделенных рас фага, для ти- 45 пизации фагов в прямом методе фаготипирования очаг в холеры и при бактериологическом исследовании на холеру в очагах, где циркулирует лизогенная разновидность холерных вибрионов. 50

Формула изобретения

Холерный бактериофаг 7106 для приготовления диагностических препаратов. Хранится в коллекции Ростовскоro-на-Дону государственного научноисследовательского противочумного института под номером 7106.

Морфологические признаки. Бактериофаг 7106 имеет многогранную головку, s проекции гексагональной формы, размером 500 30х450 30 A и отросток с сокращающимся чехлом длиной 1010+30 А и шириной 137 15 А. По морфологии частицы фаг 7106 относятся к V груп- пе, согласно классификации Тихоненко А. С.

Физиологические признаки, Формирование негативных колоний. Двухслойный агар Мартена (рН 7,6), приготовленный по методу Грациа с индикаторной культурой вибриона Эль Тор штамм 75 М, Через 18-24 час инкубации при 37 С колонии фага прозрачные, правильной круглой формы с четко контурированным ровным краем, диаметром 0,5-1,5 мм.

Серологические свойства. Относится к l серологическому типу холерных фагов по отечественной классификации.

Антигенные свойства. При введении кроликам вызывает выработку специфических антител против фагов,V типас

Антигенные свойства бактериофага 7106 стабильны. Титр сыворотки 1:250, за

5 мин нейтрализует 100% корпускул гомологического фага. Титр бактериофага 7106 по Грациа а,<10, по Аппельману 10". Продуцентами бактериофага являются специально подобранные нелизогенные штаммы вибрионов Эль Тор.

Оптимальная множественность инфекции 0,05-0,5.

Продолжительность одиночного цикла развития 24 мин. Урожай — 60 корпускул на одну микробную клетку.

Специфичность. ;трого специфичен.

Не лиэирует микробов других видов.

Диапазон литической активности в пределах гомологичного вида микробов.

Бактериофаг обладает широким диапазоном литического действия на вибрио» ны Эль Тор.

Источники информации, принятые во внимамие при экспертизе:

1. The 3ndinn jOurnat cj. med(ca! тавас т сЬ., 193Ú, v. 20, р. ИО1.