Способ получения штаммов продуцентов лизина

Способ получения штаммов продуцентов лизина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Соевтских

Социалистимвских

Рвспублик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

" 59Î989

°, 1

l (61) Дополнительное к авт. свил-ву Фр, (51) М, Кл

С 12 К 1/02

С 12 )3 13/06 (22) Заявлено 23.01.76 (21) 2340015/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликоваио25.10.78.Бюллетень К 39 (45) Дата опубликования описания 15.09.78

Государственный комитет

G088T8- Министров СССР оо делам иэаоретений и открытий (53) УЛК 668 394 (088..8

Иностранцы

Борманн Эрнст Иоахим, Бергтер Фридрих, Кристнер Арнульф, Мюллер Петер (П1Р ), С. И. Алиханян, Н. И. Жданова и 3. M. Зайцева (72) Авторы изобретения

Народное предприятие "Иенафарм (ГПР) и Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ

MiCrococcuS ф<Ыттт t CUB — ПРОДУБЕНТОВ ЛИЗИНА

Изобретение относится к области получения штаммов, продуцирующих аминокислоты, в частности относится к способу получения штамма hhtCWOCOCCUS gLUKONICU5g продуцирующего Li -лизин, широко применяемый в качестве добавки в корм живот- 5 ных, в пищевой промышленности и медицине.

В настоящее время для получения штаммов-продуцентов метаболитов, в частности аминокислот, применяют метод обработ ttt ки исходных штаммов физическими или химическими мутагенными факторами, например нитрозогуанидином, диэтилсульфатом и др. Однилт из известных способов получают штаммы-продуценты аминокислот, об- 15 ладающие потребностью в различных рос товых факторах (биохимические или ауксотрофные мутанты ) (11

Согласно этому способу для получения

4 -лизина применяют штамм NtCrpCOCCUS ЛЭ

g сц ЬМ ттт t С ц б, недостаточный по биотину, гомосерину, изолейцину и валину.

При изучении особенностей процесса биосинтеза L — лизина у штамма Ntcro2

coccus QEu1аттт(сиЬ T-3

ИОттт, t G/ уО R установлено, что при увеличении в среде содержания 1, -иэоле,."е-цитта по отношению к 4 — валину скорост : роста, выход биомассы и уровень бпосинтеза лизина резко снижаются.

Цель изобретения — создать для пол.-,--. чения 1, -лизина методом непрерывной фер-: ментации штамм hhicrocpccus $2tttctmjcttg ° который не восприимчив к колебаниям коицентрации изолейцнна и валина прежде всего в отношении скорости роста и обр::::— зования биомассы, создать таким образом предпосылки для исключения отрицательного влияния нестандартных источников питательных веществ (мелиссы, белковых гидролизатов), используемых при непрерывном культивировании MtCrocpccuS

g Ru tot m t c us для получения L -лизина и повысить эффективность проце ".а ферментации за счет более экономичного использования сырья.

Предлагаемый способ обеспечивает: лучение нового штамма-селектанта +tet., coccUe g Eutotm

59098 руюшего Ь -лизин с экономическим коэффициентом по треонину, равным не менее 50, независимым ог концентраций изолейцина и валина, соотношение которых равно (1 - 16): 1, и с удельной скоростью pocra в укаэанных условиях 0,20,33 ч

Новый штамм получают в непрерывной культуре нв минеральной среде с добавлением необходимых органических комло- 1о ненгов при лимитации треонина и-избытке кислорода, соотношении изолейцинв и валина равно 0,25: 1, скорости разбавления ,около 0,1 ч после повышения устано- вившегося в равновесном состоянии 15 (6

> ° с добавлением необходимых органических компонентов при соотношении иэолейцина и валина. равном (1-16):1.

Изолированные культуры показывают более высокий выход биомассы на едини- 2$ цу субстрата Q -греонина (1 г клеточнс . го сухого вещества на 1 r треонина), а также постоянную скорость роста при увеличении содержания иэолейцина по отношению к валину, в частности штамм-се- ЗО лектант М.ф ц дттт сцс; Т-З-1, проиоходжций от М.gP0tawicugT-З, в условиях непрерывного культивирования при изменении в среде соотношения изолейцинв и валина равном (1 - 16): l обеопечивает выход биомассы на единицу суб-. страта-треонина нв уровне 50, а скорость рост а 0,2 - О,ЗЗ ч <.

Штамм образует на комплексных средах по крайней мере ЗО-40 г/лQ ëèçèíà в периодическом процессе и 25 г/л в непрерывном.

Пример. 24-часовую культуру штамма М.gRutae 1СЬЬ Т-З, выращенную на скошенном мясном вгаре, смывают дио-4 гиллированной водой и помещают в dpH колбы емкостью 450 мл со 100 мл питательной среды.

Б 1 и питательной среды содержится

2 г сахарозьт>:500 мг казвлжнокислог (без витаминов, фирма D ($ со );

2,72 r КН Z РО ° 7,16 r Na

0,535 г ИН (Ск; О>04 г Mg CE< . 6Н О;:

0,05 r FeC2n > 0,004 г МрС 2, 6,5 мг

L, -метионина," 30 лт l -греонийа; 20 мг

L -валина; 20 мг 1> -иэолейцина 10 мг .1 - пантогенага; 20 мл L — лейцнна;

4

100 мкг ферриоксамина В; 20 мкг биотина.

Среду стерилизуют при 120 С в течение 20 мин, pH до стерилизации 6,8, р Н после стерилизации 6>9 — 7,0.

Культура в колбах инкубируется при о

28 С на качалке, делающей 150 o6/мин.

Через 20 ч путем измерения оптической плотности определяют концентрацию клеток спектрофотометрическим методом при длине волны 560 нм, которая должна составлять 150-200 мг/л по сухому весу. Затем 250 мл культуры помещают в сосуд с рабочим объемом 250 мл, на дне которого находится стеклянный фильтр (4ГО ИО . Через кульгуральную жидкость пропускают воздух. Лополнительнуто тельную среду подают в кульгуральную жидкость с помощью H&cocB со скоростью

25 мл/ч. Этв среда имеет тот же состав, что и посевная, но отличается концентрацией следующих аминокислот: 10 мг ),— метионина, 20 мг l »треонина, 80 мг 4

-валина, 20 мг L -иэолейцина.

Пробы для определения концентрации . клеток отбирают через каждые 12 ч, 5%8& С() — Qto tg характеризуется следующими параметрами: биомасса (по сухому весу) 150-200 мг/л; температура

28 + 1 С; р Н 7,0 — 7, 2; скорость раео бавления 0,1 ч, аэрация 250 мл/мин (1;1).

Увеличение концентрации биомассы до

250.-300 мг (по сухому весу) указывает на накопление селекгвнтов.6&ad(В ст т.6 с новым уровнем биомассы сохраняется в течение 10-12 дней, прежде чем приступают к изоляции нового штамма. йы изоляции и дальнейшего изучения свойств нового штамма используют комплексную агаризованиую среду и жидкую минеральную среду без или с добавлением необходимых аминокислот.

Новый штамм МфИЬЛ пт сн Т-3 по своим основным генетическим свойствам (потребносгь в биогине,гомосерине, изолейцине и валине) подобен родительскому штамму. Инокулят культуры нв минерала ной среде с необходимыми органическими компонентами, по cocraay соответствующей среде, использованной в хемостаге, через 24 ч роста в количестве 5% переносят в серию колб, содержащих 100 мл среды. Состав среды в этих колбах в основном соответствует составу среды в хемосгате, за исключением концентрации следующих аминокислот: 50 мг l, -метио5 5909 нина; 10 мг « -треонина 20,40,80,160 и ЗЙО мг«, -изолейцина 20 мг Ь -валина.

Таким образом, соотношение концентраций иэолейцина и валина в различных ва- 5 риантах сред равно (1-16):1. Скорость роста pl при любом соотношении изолейцина и валина равна 0,33 ч 1. Выход биомассы на единицу субстратагреонина повышается от 30 до 50 и остается по- 10 стоянным в указанных условиях. Перечисленные новые свойства штамма являются наследственно закрепленными и стабильно сохраняются при пересевах культур.

Способ получения штаммов М1С ОсОСсО

gROKQMicUB - продуценгов лизина, пре- 26 дусматривающий их культивирование в пи тательной среде и последующий отбор, о г л и ч а ю шийся тем, что, с целью получения штаммов, обеспечивающих в режиме непрерывной ферменгации более

Формула изобретения

89 () высокий выход биомассы на единицу субстрата, а также постоянную скорость роста при различных соотношениях в питателен ной среде изолейцина и валина, исходный штамм культивируют в непрерывном прс . цессе в питательной среде, содержащей источник углерода, азота, необходимые минеральные соли и органические добавки при лимитации треонина, избытке кислорода в соотношении изолейцина и валина равном 1: 4 и скорости разбавления

0,1 ч -1, а затем после повышения установившегося в заданном режиме ферментации уровня биомассы осуществляют

15 отбор накопившихся селекгантов путем изолирования их на комплексной агаризованной среде и последующего испытания на минеральной среде с добавлением необходимых органических компонентов при соотношении изолейцина и валина равном (1 — 16): 1.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство СССР

N 174940, кл. С 12 33 13/06, 1976.

Составитель М. Андреева

Редактор Л. Письман Техред Н, Андрейчук Корректор «4. Ковалева

Заказ 6097150 Тираж 526 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113О35, Москва, Ж-35, Раушская наб., a. 4-/5

Филиал ППП «Патент, r. Ужгород, yn . Проекгная, 4