Способ получения белка

Способ получения белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИКАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 591154 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 28. 04,7 3 (21) 19 1557 О/28-1 3 (23) Приоритет — (32) 03.05.72 (31) 6 589/7 2 (8З) Швейцария (43) Опубликоваио30.01. 78.Бюллетень № 4 (45) Дата опубликования описаниями а. Oi. 7b (51) M. Кл.

С 12 1) 13/06

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР па делам изооретений и открытий (088. 8) Ин ос транцы

Ярослав Дазек и Кнут Руд Тцаелнес (Швейцария) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Сосьете де Продюи Нестле С. А." (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА мов, т. е. источники углерода и азота, например, углеводы и(или углеводороды, азотсодержащие вещества, минеральные соли. Она может содержать стимуляторы роста, например витамины, а также кислород, если микроорганизм живет и размножается в аэробных условиях.

Микроорганизмы выращивают в ферментере, заполненном питательной средой, в условиях аэрации кислородом при температуре 20 — 50 С и рН 3,0 — 8,0. В питательную среду, желательно в показательной фазе роста микроорганизмов, добавляют антибиотик или смесь нескольких антибиотиков в таком количестве, чтобы рост не приостанавливался и чтобы протеины, содержащиеся в клетках, не выходили в питательную среду.

Согласно способу определяют ряд концентраций, соответствующих системе «микроорганизм — антибиотик». Верхний предел этого ряда может быть определен для рассматриваемой системы путем измерения концентрации анти20 биотика питательной среды, начиная от которой рост микроорганизма останавливается. Остановка роста происходит обычно некоторое время после добавления антибиотика в питательную среду. Для бактерии Sarcina lutea

25 концентрации антибиотика в питательной среИзобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для получения внутриклеточных веществ микробиологического происхождения: белков, фер лентов, нуклеиновых кислот или пигментов.

Известен способ получения белка, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в присутствии антибиотика с последующим выделением бел(1)

Однако по известному способу в питательную среду, содержащую микроорганизмы, добавляют антибиотик с повышенной концентрацией, что вызывает нарушение кинетики роста микроорганизмов.

Целью изобре гения является повышение выхода целевого продукта.

Для достижения поставленной цели перед введением антибиотика в культуральную среду определяют его концентрацию в культуральной среде, при которой приостанавливается рост микроорганизмов, а затем в питательную среду вносят антибиотик в количестве 5% от этой концентрации.

Способ заключается в следующем.

Питательная среда для выращивания микроорганизмов содержит вещества, необходимые для размножения клеток этих микроорганиз(53) УДК 577 ..15.663. 1

591154 де, при которых происходит остановка роста, составляют 0,05 международной единицы (ME) для пенициллина G, 100 мг/мл для Д-циклосерина и 30 мг/мл — для бактитрацина. Нижний предел этого ряда концентраций составляет как правило -5Р/р значения верхнего предела ряда. Это означает, что при более низких концентрациях ослабление клеточных перегородок становится незначительным и не оказывает существенного влияния на эффективность деления клеток в ходе последующего процесса разрыва.

Концентрацию антибиотиков в питательной среде для рассматриваемой системы выбирают между двумя крайними значениями в зависимости от требований, предъявляемых к способу. Концентрация антибиотиков, выбранная в верхнем пределе, вызывает некоторое уменьшение степени роста микроорганизма, сопровождающееся большим увеличением числа раздробленных клеток для данного уровня энергии дробления (например для какого-то рабочего давления гомогенизатора). Если изменение кинетики роста нежелательно, целесообразнее применять более слабые концентрации антибиотиков, что предполагает использование более мощной энергии дробления (по сравнению с предыдущим случаем) для получения той же эффективности дробления.

Культуру микроорганизмов выдерживают в ферментере в течение нескольких часов, затем биомассу отделяют от питательной среды, например центрифугированием, декантированием или фильтрацией, клетки промывают и переводят в водную суспензию. Суспензию подвергают механической обработке гомогенизатором или соответствующей мельницей, вызывающих разрыв клеточных перегородок.

Пример 1. Бактерии Sarcina lutea выращивают в 1,5 л стерилизованной водной питательной среды, рН 6,5 которой устанавливают до стерилизации. Состав этой среды следующий,Р/р.

МН,С 0,100

Мд$0,.7Н,О 0,050

К HPO 0,100

Fe SO 4 . 7Н 0 0,001

СаСВ, 1,010

Пептон 1,000

Дрожжевой экстракт 0,500

Сахароза 0,500

Вода До 100.

Выращивание продолжают 24 ч при 25 С в аэробных условиях в колбе, взбалтываемой путем вращения. Затем полученную культуру вводят в 9 л водной питательной среды, находящейся в 14-литровом ферментере. Эта питательная среда имеет тот же состав, что и вышеописанная, но содержит 1Р/р дрожжевого экстракта и 2 /р сахарозы.

Бактерии выращивают в ферментере при

25 С, перемешивая питательную среду мешалкой, вращающейся со скоростью 250 об/мин; вентиляция обеспечивается путем подачи 7 л воздуха в минуту при атмосферном давлении.

В показательной фазе роста в питательную среду добавляют пенициллин G с таким расчетом, чтобы получить концентрацию пенициллина, равную 0,04 Международной единицы (ME) на 1 мл питательного бульона. Культуру бактерий выдерживаю 9 ч, а затем отделяют бактерийные клетки от питательной среды пу5 тем центрифугирования.

Полученные клетки промывают и помешают во взвешенном состоянии в воду из расчета

30 г сухого вещества на 1 л воды. Затем водную суспензию обрабатывают механическим путем в дробильной установке Rl Bl при давлении 700 — 1000 атм.

Количество разорванных клеток, определенное путем дозирования освобождающегося азота, составляет 20 /р от общего числа клеток.

1 Аналогичная механическая обработка, проведенная с клетками $агс(па lutea, выращенными при тех же условиях, но при отсутствии антибиотиков, вызывает разрыв только 4 /р клеток.

В то же время добавление 0,04 МЕ пенициллина G на 1 мл питательной среды увеличивает лишь на 10 /р время димеризации микро. организма, т. е. оказывает очень незначительное влияние на кинетику воспроизводства мик роорганизма.

Пример 2. Бактерии Bacillus megaterium выращивают в 0,5 л питательной водной среды, рН которой устанавливают 6,5 до стерилизации.

Состав среды, Р/0. зо (NH ) HP04 1,000

K21 l 0 4 0,500

° Ха SO 0,500

VgSO,.7Н,О 0,400

Ге$0 4 7Н 0 0,002

NaCE 0,002

Дрожжевой экстракт 0,025 жидкость м ацерации кукурузы 0,025

Сахароза 2,000

Вода До 100, Выращивание продолжают 24 ч при 30 С в аэробных условиях и при помешивании путем встряхивания. Затем 5 /o полученной культуры вводят в 9 л водной питательной среды, находящейся в 14-литровом ферментере и имеющей тот же химический состав, что и инкубационная среда. Бактерии выращивают при

30 С, перемешивании со скоростью 250об/мин, расходе воздуха 7 л в 1 мин, при атмосферном давлении. В показательной фазе роста в питательную среду добавляют 4 мг/мл бактитрацина. После 9 ч роста в этих условиях

so бактерийные клетки отделяют от питательной среды путем центрифугирования.

Собранные, промытые и помещенные в водную суспензию клетки подвергают механической об работке аналогично примеру 1.

Количество разорванных клеток, определенных по способу, описанному в примере 1, составляют 61Р/р от общего числа клеток. Аналогичная механическая обработка клеток ВасИlus megaterium, выращенных в тех же условиях, но без добавки антибиотиков, вызывает

6о разрыв 26Р/р клеток.

591154

0,025

Пример 3. Бактерии .Micrococcus cerificans выращивают в водной питательной среде следующего состава,%: (NH4) 2НР04 1,000

К НРО, 0,500

Na 2504 0,500

MgSO4 7Н О 0,400

FeSO4 7Н О 0,002

NaC(0,002

Дрожжевой экстракт 0,025

Жидкость мацерации о кукурузы

Смесь линейных парафинов С вЂ” С 2,000

Вода До 100.

Культуру выдерживают в ферментере при

30 С в аэробных условиях. В показательной фазе роста микроорганизма добавляют циклосерин из расчета 100 мг на 1 мл питательной среды.

После 8 ч роста в этих условиях клетки изолируют и обрабатывают механическим путем аналогично примеру 1. Количество разорванных клеток для культуры, выращенной в присутствии антибиотика, и для культуры, выращенной без антибиотика, составляет соответственно 75% и 57%.

Пример 4. Непрерывное выращивание бактерий Bacillus megaterium производят в ферментере на бульоне, полученном в результате культивирования бактерий в среде, описанной в примере 2, и при тех же условиях. без добавления антибиотика.

t5 àHàJ;огичHûê условиях выращивают те же оактерии, но добавляют в питательную среду пенициллин G из расчета 1,5 МЕ на 1 мл среды, Биомассу, отделенную путем центрифугирования от вытекающего из ферментера элюента, промывают, вводят в водную суспензию и обрабатывают в гомогенизаторе Manton Gaulin под давлением 700 атм. Количество разорванных клеток для культуры, выращенной с добавлением антибиотика, составляет 65%, для культуры, выращенной в тех же условиях, но в отсутствии антибиотика — 20%.

Пример 5. Непрерывное выращивание бактерий Sarcina lutea производят в ферментере на питательной среде, описанной в примере 1, которая содержит 0,04 МЕ пенициллина на 1 мл.

Клетки, отделенные от вытекающего из фер- 4s ментера элюента, промывают, вводят в водную суспензию и обрабатывают, как описано в примере 4. Количеетво разорванных клеток 25%, для клеток же выращенных в аналогичных условияя х, но без анти б иоти ка — 5%.

Пример б. Бактерии Lactobacillus helveticus АТСС № 45807 выращивают в аэробных условиях на питательной среде, представляющей собой раствор в деминерализованной воде твердых веществ сыворотки молока и 0,1 вес.% жидкости мацерации кукурузы. Среду стерилизуют 30 мин при 120 С. Выращивание произ55 водят в 14-литровом ферментере при температуре 42 С и перемешивании мешалкой со скоростью вращения 15 об/мин. рН среды поддерживают равным 5,5, добавляя водный раствор гидроокиси калия. Спустя 5 ч после посева бактерий в питательную среду добавляют стерильный раствор пенициллина G с таким расчетом, чтобы концентрация его составляла

0,03 МЕ на 1 мл среды. В этих условиях выращивание продолжают 15 ч, затем отбирают 9 л полученного питательного бульона, клетки отделяют центрифугированием, промывают и помещают в водную суспензию.

Водную суспензию подвергают механической обработке в гомогенизаторе Manton Gaulin под давлением 700 атм. Разрыв клеток для культуры, выращенной в присутствии антибиотика, составляет 90%, для культуры, выращенной без антибиотика — 55%.

Пример 7. Бактерии Sarcina lutea непрерывно выращивают в питательной водной среде состава, %:

NH„С 0,100

MgSO,. 7НО 0,050

К НРО 0,100

FeSO, 7Н.О 0,001

СаСЕ 0,001

Пептон 1,000

Дрожжевой экстракт 0,500

Сахароза 1,500

Вода До 100.

Питательная среда, непрерывно вводимая в ферментер, содержит 0,04 МЕ пенициллина

G на 1 мл. Выращивание производят при 27 С в аэробных условиях при перемешивании со скоростью 400 об/мин.

Клетки, отделенные от вытекающего из реактора элюента, промывают и вводят в водную суспензию, а затем обрабатывают механическим путем в гомогенизаторе Duno—

М111 (производительность 5 л/час, снабжен стеклянными шариками диаметром 0,2 мм).

Происходит разрыв 85% клеток; при аналогичной механической обработке водной суспензии клеток, выращенных при тех же условиях, но без антибиотика, происходит разрыв лишь

65% клеток.

Формула изобретения

Способ. получения белка, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в присутствии антибиотика с последующим выделением белка, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, перед введением антибиотика в культуральную среду определяют его концентрацию в культуральной среде, при которой приостанавливается рост микроорганизмов, а затем в питательную среду вносят антибиотик в количестве 5% от этой концентрации.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Великобритании № 1 141 940, кл. С 6 F, 1969.